總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(NBT核黃素比色法)

1、總超氧化物歧化酶 (SOD)檢測試劑盒 (NBT核黃素比色法 )產(chǎn)品簡介：超氧化物岐化酶 (Superoxide Dismutase, SOD)是含金屬輔基的酶，能催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成過氧化氫(H2O2) 和氧氣 (O2) ，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶。由于超氧自由基是不穩(wěn)定的的自由基，壽命極短，SOD活性一般用間接方法測定，并利用各種呈色反應(yīng)來測定SOD活力，其中顯色劑有NBT(四氮唑藍 ) 、WST-1、WST-8等?？偝趸锲缁?SOD)檢測試劑盒 (NBT 核黃素比色法 )(Total Superoxide Dismutase AssayKit with NBT)

2、是一種基于 NBT的顯色反應(yīng)，通過比色來檢測組織、細胞、植物、血清或其它樣品中SOD即超氧化物歧化酶活性的試劑盒。其檢測原理是SOD抑制 NBT在光照下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化合物存在的情況下，核黃素被光還原，后經(jīng)一系列的反應(yīng)可將NBT還原為藍色的甲臜(formazan) ，后者在 560nm處有強吸收。 SOD可清除超氧陰離子 (O2.- ) ，從而抑制了甲臜的形成。反應(yīng)液藍色愈深，說明超氧化物岐化酶活性愈低，反之則酶活性愈高。據(jù)此通過比色分析就可以計算出超氧化物岐化酶活性水平。本試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。產(chǎn)品組成：名稱50T100TStorage試劑 (

3、A):SOD 檢測緩沖液250ml500mlRT試劑 (B):NBT 顯色液15ml30ml-20 避光試劑 (C): 酶溶液15ml30ml-20 避光試劑 (D): 反應(yīng)啟動液10ml20ml4使用說明書說明書自備材料：1、生理鹽水或PBS2、離心管、小試管或96 孔板3、分光光度計或酶標(biāo)儀4、水浴鍋或恒溫箱5、離心機操作步驟 ( 僅供參考 ) ：1、樣品處理：血漿或含紅細胞的樣品：從待測樣品中分理出的血清或血漿不應(yīng)有溶血，如果含有應(yīng)去除紅細胞后檢測，如超過檢測范圍，用SOD檢測緩沖液稀釋后檢測。血清去除紅細胞的簡易方法如下：用抗凝管收集血液，顛倒混勻。取至少 500l全血， 43000g

4、 離心 5min。轉(zhuǎn)移上清至另一新的1ml 離心管中，適量生理鹽水稀釋后待測。亦可采用紅細胞裂解液去除紅細胞，如Leagene ACK 紅細胞裂解液等。組織樣本：動物用含有20U/ml heparin 的生理鹽水 (0.9% NaCl containing 20U/ml heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照每100mg組織加入500l SOD檢測緩沖液的比例，用玻璃勻漿器在4或冰浴勻漿。 4， 4000g 離心 10min。取上清液 (SOD粗提液 ) 用于酶活性的測定。細胞樣本：對于貼壁細胞，由于后續(xù)用于酶活性的測定，避免使用胰酶消化細胞?？梢允褂糜眉毎位?EDTA處理細胞收集

5、細胞。細胞用無菌的 PBS或生理鹽水洗滌 1 次。按照每 106 細胞加入 300-500l SOD檢測緩沖液的比例用玻璃勻漿器在 4或冰浴勻漿， 4 10000g 離心 10min，取上清液(SOD粗提液 ) 用于酶活性的測定。上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以 BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。通常 10-20g蛋白的細胞或組織勻漿液樣品其中的 SOD平均活力約 1 個活力單位左右 ( 不同細胞和組織的差異會比較大，該活力范圍僅作為初步的參考) 。每種樣品準(zhǔn)備20-100g蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測。根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計的蛋白使用量，用本試劑盒提供的SOD檢測緩沖液適當(dāng)稀釋樣品。例如，小鼠肝臟組

6、織10%勻漿液 ( 組織和勻漿液的重量比為 10%)上清，通常需要稀釋 10-100倍。準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測定，可以冰浴保存；如果當(dāng)天不能完成測定，可以-70 凍存，但建議盡量當(dāng)天完成測定。2、NBT/酶工作液的配制：按照每個反應(yīng)1.6ml 的體積，均勻混合1ml SOD檢測緩沖液、 0.3ml NBT 顯色液、 0.3ml 酶溶液，即可配置成 1.6ml NBT/ 酶工作液，根據(jù)待檢測樣品 ( 包括標(biāo)準(zhǔn)品 ) 的數(shù)量，配置適量的 NBT/酶工作液。具體配置方法可以參考下表。配制好的NBT/酶工作液 4或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。注意：由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注

7、意在使用前先輕輕離心一下，然后適當(dāng)混勻后再使用。1 次10 次20 次SOD檢測緩沖液 (ml)1.01020NBT顯色液 (ml)0.336酶溶液 (ml)0.336NBT/酶工作液 (ml)1.616323、( 可選做 ) 準(zhǔn)備 SOD標(biāo)準(zhǔn)品：需自備 SOD標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的 SOD檢測緩沖液將 SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度： 200U/ml ， 100U/ml ，50U/ml ，20U/ml ，10U/ml ， 5U/ml ， 2U/ml 。在隨后的檢測中可以各取 20l ，參考樣品進行檢測。說明：為避免稀釋后 SOD酶活性的下降， SOD標(biāo)準(zhǔn)品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用。本試劑盒對于 SOD的檢測并不需要 SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品，但可以使用 SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照或作為對 SOD活性定量的參考。4、參考下表使用小離心管或試管設(shè)置空白對照管、光照對照管、測定管。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液，加入反應(yīng)啟動工作液后充分混