基因工程實驗教學教案

1、基因工程實驗教學方案湖南人文科技學院生命科學系生物技術(shù)教研室指導教師：吳娟實驗一 重組質(zhì)粒的提取及轉(zhuǎn)化表達型菌株 質(zhì)粒DNA的提取實驗目的 通過本實驗學習和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒的技術(shù)與方法。實驗原理1堿變性法基本原理是，在Ph12.0-12.6堿性環(huán)境中，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)。將PH調(diào)至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細胞碎片，染色體DNA，RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿或硅基質(zhì)膜柱子進一步純化D

2、NA。2設計構(gòu)建體外重組DNA分子構(gòu)建體外重組DNA分子，首先要了解目的基因的酶切圖譜。選用的限制性內(nèi)切酶不能在目的基因內(nèi)部有識別位點，也就是說用一種或兩種限制性內(nèi)切酶就能切割得到完整的外源DNA基因。構(gòu)建體外重組DNA分子，最簡單的重組方式就是在目的基因DNA的兩端用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進行酶解，產(chǎn)生兩個不同的粘性末端。再用這兩種限制性內(nèi)切酶去選擇合適的載體進行酶切，也產(chǎn)生這兩個不同的粘性末端，這樣構(gòu)建的重組DNA分子，目的基因DNA片段是從一個方向插入質(zhì)粒載體中的，重組的效率高，也易于篩選處重組子。附表達載體pGEX-6P-1-mreB的構(gòu)建圖：儀器材料與試劑（一）儀器1恒溫搖床 2臺式

3、離心機3漩渦混合儀（二）材料與試劑1含pGEX-mreB質(zhì)粒的大腸桿菌DH52 含pGEX質(zhì)粒的大腸桿菌DH53液體LB培養(yǎng)基4100mg/mL氨芐青霉素Amp5新捷質(zhì)粒提取試劑盒實驗步驟分為兩組：一組提取質(zhì)粒pGEX-mreB，另一組提取質(zhì)粒pGEX。1）12000rmp 離心30秒收集1-5ml過夜培養(yǎng)的細菌，棄盡培養(yǎng)基。加入250ul已加入Rnase A的Buffer , 充分懸浮細菌沉淀。2）加入250ul Buffer , 溫和并充分地翻轉(zhuǎn)離心管4-6次。3）加入350ul Buffer ,溫和并充分地翻轉(zhuǎn)離心管4-6次。4）13000 rmp 離心10分鐘。5）將核酸純化柱置于2m

4、l 離心管中，轉(zhuǎn)移步驟4中的上清液到核酸純化柱中，蓋上管蓋，12000rmp離心30秒。6）棄2ml 離心管中的濾液，將核酸純化柱置回到2ml離心管中，在核酸純化柱中加入700ul Buffer W2,蓋上管蓋，12000rmp離心30秒。7）棄2ml離心管中的濾液，將核酸純化住置回到2ml離心管中，14000 rmp離心1分鐘。8）棄2ml離心管，將核酸純化住置于一個潔凈的1.5ml離心管中，在純化柱的膜中央加入50-100ul Buffer TE ,蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，12000rmp離心30秒。9）棄純化柱，洗脫的質(zhì)?？闪⒓从糜诟鞣N生物學實驗，或儲存于-20。實驗結(jié)果 實驗安排3個

5、小時 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化實驗目的通過本實驗，掌握大腸桿菌轉(zhuǎn)化的方法與技術(shù)。實驗原理細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組子導入細菌的過程。其原理是細菌處于0、CaCl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸DNA復合物粘附于細胞表面，經(jīng)42短時間熱激處理，促進細胞吸收DNA復合物。將細胞放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型（如Ampr等）得到表達，然后將此細胞培養(yǎng)物涂在選擇性培養(yǎng)基上。E.coli DH5是一種用于質(zhì)?？寺〉木辍.coli BL21是一種適合于外源蛋白表達的菌株，

6、其內(nèi)源性的蛋白酶基因缺失。儀器材料與試劑（一）儀器1. 超凈工作臺2. 恒溫搖床3. 制冰機4. 高壓滅菌鍋(二) 材料與試劑1.大腸桿菌Bl21感受態(tài)細胞2.質(zhì)粒DNA： pGEX-mreB、pGEX。3固體LB培養(yǎng)基平板（含Amp 120ug/ml）實驗步驟分為兩組：一組加入質(zhì)粒pGEX-mreB，另一組加入質(zhì)粒pGEX。1.取100ul 新鮮制備的感受態(tài)細胞，加入質(zhì)粒DNA 2ul混勻，冰上放置30min。同時做一個對照管，僅加入100ul感受態(tài)細胞，不加質(zhì)粒。2.將管放到42熱激90s。3.冰浴2min。4.每管加400ul LB 液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1h(150r/min)5將適當體

7、積（200ul）的復蘇細胞，涂布在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)皿中，正置平皿30min。6.倒置平皿37培養(yǎng)12-16h,出現(xiàn)菌落。實驗結(jié)果實驗安排這整個大實驗從質(zhì)粒提取到轉(zhuǎn)化需一天，第二天早晨觀察結(jié)果。實驗二 外源基因在大腸桿菌中的誘導表達和檢測 外源基因在大腸桿菌中的誘導表達實驗目的通過本實驗了解外源基因在原核細胞中表達的特點和方法。實驗原理將外源基因mreB克隆在含有Tac啟動子的表達載體pGEX中，讓其在E.coli中表達。先讓宿主菌生長，lacI產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結(jié)合，從而不能進行外源基因的轉(zhuǎn)錄及表達，此時宿主菌正常生長。然后向培養(yǎng)基中加入lac操縱子的誘導物IPTG（異丙基

8、-D-硫代半乳糖苷），阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，則外源基因大量轉(zhuǎn)錄并高效表達。表達蛋白可經(jīng)SDS-PAGE進行檢測，或做蛋白質(zhì)印跡，用抗體識別表達蛋白。Tac啟動子：Tac啟動子是一組由Lac和trp啟動子人工構(gòu)建的雜合啟動子，受Lac阻遏蛋白的負調(diào)節(jié)，它的啟動能力比Lac和trp都強。其中Tac 1是由Trp啟動子的35區(qū)加上一個合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操縱基因構(gòu)成，Tac 12是由Trp的啟動子-35區(qū)和Lac啟動子的-10區(qū)，加上Lac操縱子中的操縱基因部分和SD序列融合而成。Tac啟動子受IPTG的誘導。 儀器材料和試劑（一） 儀器1. 恒溫搖床

9、2. 離心機3. 超凈工作臺4. 分光光度計（二） 材料與試劑1.含pGEX-6P-1-mreB表達質(zhì)粒的表達菌株E.coli BL21（DE3）plysS2. 含pGEX-6P-1表達質(zhì)粒的表達菌株E.coli BL21（DE3）plysS2.液體LB培養(yǎng)基3.100mg/mL氨芐青霉素Amp4. 1mol/L IPTG實驗步驟1. 挑取一含有pGEX-6P-1-mreB表達質(zhì)粒的單菌落到1.5mL含有100g/mLAmp的液體LB培養(yǎng)基中，37度搖12小時。2. 挑取一含有pGEX-6P-1表達質(zhì)粒的單菌落到1.5mL含有100g/mLAmp的液體LB培養(yǎng)基中，37度搖12小時。（這是不含

10、目的基因僅含載體的對照）。3. 將培養(yǎng)的菌液1mL 接種于 200mL含有100g/mLAmp的液體LB培養(yǎng)基中，37度搖至A600 0.6。4. 向其中一瓶加入IPTG至終濃度 0.4mmol/L ,另一瓶不加（對照），轉(zhuǎn)至28度誘導過夜。5. 8000r/min 離心 收集菌體細胞沉淀，四種類型分別做好標記，-20度保存。注（四種類型分別為： pGEX-6P-1-mreB轉(zhuǎn)化菌 誘導，pGEX-6P-1-mreB轉(zhuǎn)化菌 未誘導， 不含目的基因的pGEX-6P-1轉(zhuǎn)化菌 誘導，pGEX-6P-1轉(zhuǎn)化菌 未誘導。） SDS-PAGE檢測表達蛋白實驗目的通過本實驗了解和掌握SDS-PAGE檢測蛋

11、白的基本原理和操作。實驗原理SDS（十二烷基硫酸鈉）是一種陰離子去污劑，在溶液中能與蛋白質(zhì)分子的疏水部分定量結(jié)合，把大多數(shù)蛋白質(zhì)拆成亞單位，并帶上陰離子。這些陰離子掩蓋了蛋白質(zhì)分子本身所帶的電荷差異，所以SDS-PAGE消除了電荷效應，只有分子篩效應故蛋白質(zhì)電泳遷移率完全取決于相對分子質(zhì)量，遷移率與相對分子質(zhì)量對數(shù)呈線性關(guān)系，在電場下，按相對分子質(zhì)量大小在板狀膠上排列。儀器材料和試劑（一）儀器1.垂直板電泳槽及配套的玻璃板、封膠條、梳子2.恒壓恒流電泳儀3.脫色搖床（二）材料與試劑 PBS緩沖液2LaemmLi樣品緩沖液：100 mmol/L Tris-HCl（pH6.8），4%SDS，0.0

12、2%溴酚藍，20%甘油，臨用前加入100L巰基乙醇到900L上樣液中。 30%丙烯酰胺儲液：丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺29：1 (W/W)，置于棕色瓶中于4，隔幾月需重配。分離膠緩沖液：1.5mol/L Tris-Cl pH8.8濃縮膠緩沖液：1mol/L Tris-Cl pH6.810%SDS(W/V)(十二烷基硫酸鈉)10APS（W/V）（過硫酸胺）：取0.1g APS定容至1mL，少量配制，隔周新配。電泳緩沖液：3.03g Tris-base，14.4g Glycine，1g SDS，加蒸餾水至1L。固定液：40乙醇，10乙酸Blue silver染色液：0.12考馬斯亮藍G-250，10

13、（NH4）2SO4，10H3PO4，20甲醇。實驗步驟1(1) 按上述方法誘導的菌，離心收集菌體，用PBS懸浮菌體；(2) 超聲破碎細胞，12,000 r/min離心分離上清和沉淀；(3) 上清和沉淀與2上樣緩沖液1:1混勻，并在100水浴中煮10min，取出待用。(4)上清和沉淀分別跑SDS-PAGE，觀察目的蛋白處于哪個組分，若在上清中則為可溶性表達，若在沉淀中則為包涵體。2.配置12%分離膠雙蒸水分離膠緩沖液30%膠貯液10%SDSTEMED10%AP2.56mL2.08mL3.2mL80uLuL80uL（1） 把玻璃板放入制膠架上，架好膠板，用瓊脂封底。（2） 按如下比例配好分離膠，混

14、勻后立即加入到兩玻璃板之間，到上口大于梳子插入的長度止，再加一層異丙醇，約30min等膠自然凝聚后傾斜倒出異丙醇，并用蒸餾水洗三次，倒干凈蒸餾水。3.配置4%的濃縮膠雙蒸水分離膠緩沖液30%膠貯液10%SDSTEMED10%AP2.8mL0.5mL0.66mL40uLuL40uL混勻后立即加到分離膠上，在兩玻璃板夾縫中水平插入1.5mm的梳子，用瓊脂封住梳子兩端。聚合后，把玻璃板放入電泳槽中，裝好電泳緩沖液后小心拔出梳子。4.丄樣、電泳：將樣品和標準蛋白分別加到樣品孔中開始電泳，先恒壓80V，樣品進入分離膠后恒壓120V，直至溴酚藍走至前沿為止。5固定染色：電泳完畢，將膠板從電泳槽中取出，小心

15、從玻璃板上取下凝膠，將凝膠在固定液中固定30min,用蒸餾水洗三次，每次10min,再將凝膠在染色液中染色2h。實驗結(jié)果實驗安排第一天晚上挑菌落預培養(yǎng)第二天：誘導表達第三天：制膠，跑SDS-PAGE電泳檢測。 實驗三 蛋白質(zhì)印跡實驗目的通過本實驗了解蛋白質(zhì)印跡的方法和操作要點。實驗原理印跡法一般由：凝膠電泳；樣品的印跡和固定化；各種靈敏的檢測手段如抗原抗體反應等三大實驗部分組成。1. 生物大分子凝膠電泳分離:蛋白質(zhì)印跡法的第一步一般是將蛋白質(zhì)進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）,使待測蛋白在電泳中按分子相對質(zhì)量大小在板狀膠上排列。2. 分子區(qū)帶的轉(zhuǎn)移和固定：第二步就是把凝膠電泳已分

16、離的分子區(qū)帶轉(zhuǎn)移并固定到一種特殊的載體上，使之形成穩(wěn)定的、經(jīng)得起各種處理及容易檢出，即容易和各自的特異性配體結(jié)合的固定化生物大分子?，F(xiàn)用的最多的載體材料是PVDF聚偏氟乙烯膜，它們和生物大分子是非共價結(jié)合的。3. 特異性譜帶的檢出：印跡在載體上的特異抗原的檢出依賴于抗體抗原的親和反應。即將酶、熒光素或同位素標記的特異蛋白分別偶聯(lián)在此特異抗體的二抗上，再分別用底物直接顯色、測熒光、放射自顯影等方法檢測我們感興趣的抗原，考慮到如果無合適抗體用來檢測抗原時，可用一般的蛋白染料，如麗春紅，檢測轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白，驗證轉(zhuǎn)移是否成功。 SDS-PAGE(見實驗二) 電轉(zhuǎn)移儀器材料與試劑（一） 儀器1. 電泳

17、儀2. 半干式轉(zhuǎn)移電泳槽3. 脫色搖床4. 恒溫振搖器（二） 材料與試劑1電轉(zhuǎn)緩沖液：48 mmol/L Tris-HCl，39 mmol/L GLy，0.031% SDS，20%甲醇。2TBS緩沖液(pH 7.5)：0.02mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl。3TTBS緩沖液(pH 7.5)：在TBS基礎(chǔ)上再加入0.05%（v/v） Tween-20。4封閉液：含5%（W/V）脫脂奶的TTBS緩沖液。5PVDF膜6DAB染色試劑盒7山羊抗小鼠IgGHRP8抗MreB-GST多克隆鼠抗實驗步驟1電泳結(jié)束后，取出凝膠，切角做標記，浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中。2剪取與凝膠等大的PVD

18、F膜，在甲醇中浸泡10s，再轉(zhuǎn)至電轉(zhuǎn)緩沖液中。取6張與海綿等大的濾紙和轉(zhuǎn)移裝置中的海綿浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中備用。3 將3張濾紙整齊置于海綿上，再依次放上凝膠、PVDF膜、濾紙(3張)，注意趕盡氣泡，邊界對齊，然后用海綿、篩孔板固定，插入電轉(zhuǎn)移槽中，并加入電轉(zhuǎn)移緩沖液，保證凝膠在陰極方向，PVDF膜在陽極方向。100V電轉(zhuǎn)1.5h。4 取下膠和膜，倒扣于濾紙上，用鉛筆在膜上描出膠上點樣孔位置，揭去膠，取下膜。 特異性普帶的檢出實驗步驟1 封閉：將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出， TBS稍加漂洗，浸沒于封閉液中37緩慢搖蕩2h。2 結(jié)合一抗：一抗用含4%脫脂奶粉的TTBS按適當比例稀釋。傾去封閉液，加入一抗，室溫（25）輕搖1h；3 洗滌：一抗孵育結(jié)束后，用TTBS洗膜三次，每次5-10min。4 結(jié)合二抗：二抗按1：8000用含4%脫脂奶粉的TTBS稀釋，室溫輕搖1h。5 洗滌：同