纖維蛋白沉積對(duì)老年急性肺損傷大鼠肺組織內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響_百講解

1、【摘要】目的探討纖維蛋白沉積對(duì)不同鼠齡大鼠肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影 響。方法青年及老年大鼠均隨機(jī)分為 4組，對(duì)照組（NC腹腔注射生理鹽水；脂多糖組 （L腹腔注射脂多糖；氨甲環(huán)酸組（LT注射脂多糖加氨甲環(huán)酸；尿激酶組（LTU注射脂多 糖及氨甲環(huán)酸加尿激酶。應(yīng)用免疫組化分析纖維蛋白沉積；應(yīng)用Western blot和Northern blot分別檢測(cè)肺組織血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM 1、纖溶 酶原激活劑抑制物1（PAI 1的表達(dá)。結(jié)果（1正常青年和老年大鼠肺組織內(nèi)均無(wú)纖維 蛋白沉積，脂多糖刺激后纖維蛋白沉積增多，加用氨甲環(huán)酸纖維蛋白沉積更加明顯 （P<0 01,應(yīng)用尿激

2、酶后纖維蛋白沉積明顯減輕（P<0 05老年大鼠L組、LT組和LTU 組均比相同干預(yù)組的青年大鼠肺組織纖維蛋白沉積明顯（P<0 05。（2青年和老年大鼠給與脂多糖刺激后，ICAM 1和PAI 1表達(dá)明顯上調(diào)（P<0 05,TM表達(dá)顯著下降 （P<0 01;加用氨甲環(huán)酸后ICAM 1和PAI 1表達(dá)上調(diào)更加明顯（P<0 01,TM幾乎無(wú)表 達(dá);給予尿激酶處理后,ICAM 1和PAI 1表達(dá)與L T組比較明顯下調(diào)（P<0 05,TM表達(dá) 增多（P<0 05老年大鼠L組、LT組和LTU組I CAM 1和PAI 1的表達(dá)均較青年大 鼠相同干預(yù)組顯著增多（P &l

3、t;0 05,TM表達(dá)則顯著減少。（3經(jīng)纖維蛋白沉積量校正后, 老年大鼠肺組織ICAM 1和PAI 1的表達(dá)量仍顯著高于青年大鼠（P<0 05。結(jié)論增 齡能夠促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠肺組織纖維蛋白沉積，增強(qiáng)纖維蛋白的內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用?！娟P(guān)鍵詞】纖維蛋白；肺;炎癥;內(nèi)皮細(xì)胞外界有害刺激和炎癥介質(zhì)可直接激活內(nèi)源性凝血通路，導(dǎo)致纖維蛋白沉積1。肺組織內(nèi)大量纖維蛋白沉積是多種原因?qū)е碌姆尾垦装Y的重要病理特征，目前研究表明纖維蛋白沉積不僅僅是病理?yè)p傷產(chǎn)物，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)纖維蛋白具有內(nèi)皮 細(xì)胞損傷作用2,3,但其在體內(nèi)的作用并不清楚。本研究應(yīng)用脂多糖誘導(dǎo)急性肺 損傷動(dòng)物模型4，用氨甲環(huán)酸和尿激酶

4、調(diào)控纖維蛋白沉積水平，觀察纖維蛋白沉積 對(duì)不同鼠齡大鼠肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。1材料與方法1 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備選用健康雌性 3月齡Wistar大鼠（青年鼠32只,平均體重（220 ±0g （北京試驗(yàn)動(dòng)物中心提供；27月齡雌性Wistar大鼠（老年鼠32只平均體 重（420 ±0g,（解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后青年鼠和老年鼠分別隨機(jī)分為正常對(duì)照組（C組、脂多糖組（L組、脂多糖+氨甲環(huán)酸組（L T組、脂多 糖+氨甲環(huán)酸+尿激酶組（LTU組，每組8只。參照文獻(xiàn)方法，以脂多糖（LPS,Escherichia coli serotype 055： B5

5、,Sigma,USA14 mg/kg 腹腔注射誘導(dǎo)大鼠急性 肺損傷模型。NC組大鼠腹腔注射生理鹽水3 0 ml;L組大鼠單純腹腔注射LPS;LT 組大鼠腹腔注射LPS 30 min后，給與氨甲環(huán)酸腹腔注射（湖南洞庭藥業(yè)股份有限公司 批號(hào)021002;LTU組大鼠腹腔注射LPS 30 min后腹腔注射氨甲環(huán)酸,60 min后股靜 脈注射尿激酶2 500 U/ kg（豐原藥業(yè)馬鞍山藥廠產(chǎn)，國(guó)字準(zhǔn)字H34021690。所有大鼠均于LPS 注射4 h后,用10%水合氯醛（0 4 ml/ kg腹腔注射麻醉，處死留取標(biāo)本。所取肺組織 1/3用10%甲醛固定制備石蠟包埋切片，其余肺組織立即置于液氮冷凍,隨后

6、-70 r冰 凍保存以作RNA、蛋白質(zhì)等分析。1 2主要試劑內(nèi)毒素（LPS,O55B5、苯甲基磺酰氟（PMSF、抑胰肽酶（aprotinin、亮肽素（leupeptin購(gòu)自Sigma公司;ACTIN多抗、辣根過(guò)氧化物酶（HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG、兔抗羊IgG、羊抗大鼠MCP 1單克隆抗體、ECL顯色系統(tǒng)均 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)TEL2TEST Int公司;考馬斯亮蘭G2250購(gòu)自北京邦定泰克 生物技術(shù)公司；隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒購(gòu)自寶靈曼公司。13肺組織纖維蛋白免疫組化檢查組織蠟塊2 yn切片,常規(guī)脫蠟,3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min。0 05

7、%胰酶37C抗原修復(fù)10 min,血清封閉20 min（室溫。加入纖維蛋白抗體4C孵育過(guò)夜。次日用 PBS漂洗后加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔抗體室溫孵育20 min。PBS漂洗后,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素室溫孵育20 min。PBS漂洗,DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片?？瞻讓?duì)照片不加一抗，其余步驟同上。應(yīng)用Image pro plus5 1軟件進(jìn)行圖像分析。免疫組化染色切片在光鏡下放大 400倍，每張 切片隨機(jī)選取20個(gè)不重疊視野，測(cè)定每個(gè)視野棕黃色（DAB著色的平均光密度值，取 20個(gè)視野的平均值。1 4大鼠肺組織 RNA提取及PAI 1、TM、ICAM 1的N

8、orthern blot分析利用Trizol 步法提取大鼠腎組織總 RNA,20 yg總RNA經(jīng)15%甲醛變性處理的1%瓊脂 糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至尼龍膜,短波紫外交聯(lián)固定，預(yù)雜交液60C預(yù)雜交3 h。雜交探 針通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT PCR法制備,ICAM 1的引物序列為正鏈:5 ' GA TGCT GAC CCT GGA GAG CA'3 ；負(fù)鏈:5 ' CAG GGA CTT CCC A TC CAC CT 3'擴(kuò) 增條件為 94C 3 min,94°C 45 s,55°C 30 s,72C 90 s共 35個(gè)循環(huán),最后 72C ,

9、延伸 10 min, 終產(chǎn)物長(zhǎng)度為409 bp。PAI 1的引物序列為正鏈:5 ' CAG GCC TCC AAA GAC CGA AA T GTG 3 '負(fù)鏈:5 ' TAG AGG GCG TTC ACC AGC ACC AG 3 擴(kuò)增條件為 94C 5min,94C 45 s,60 5C 45 s,72C 45 s共 35 個(gè)循環(huán)，最后 72C ,延伸 10 min,終產(chǎn)物 長(zhǎng)度為437 bp。TM的引物序列為正鏈:5 ' GGT CAG CGG CGC GGA TTT TC 3負(fù) 鏈:5 ' CA T GGA TTG GGC CCC TGC TT

10、A CA 3 擴(kuò)增條件為 94C 5 min, 94C 45 s,62C 45 s,72C 45 s共35個(gè)循環(huán),最后72C ,延伸10 min,終產(chǎn)物長(zhǎng)度為414 bpo 32P2dCTP隨機(jī)引物法標(biāo)記探針,42C雜交24 h,常規(guī)洗膜,-70C放射自顯影72 h,以28sRNA作為內(nèi)參校正 RNA取樣量應(yīng)用Image pro plus5 1軟件進(jìn)行圖 像分析，以與28sRNA吸光度的比值來(lái)表示其相對(duì)含量。1 5大鼠肺組織總蛋白質(zhì)的提取及 PAI 1、TM、ICAM 1的Western blot分析- 70C冰凍保存的肺組織加入適量緩沖液進(jìn)行組織勻漿，離心,取中間清亮液體即為組織中的總蛋白質(zhì)

11、。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)濃度，取100卩總蛋白質(zhì)變性,10% SDSPAGE膠電泳，轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉。分別加1 : 100抗Actin、PAI 1、TM和ICAM 1抗體于4C過(guò)夜,0 1%TBST洗膜后，再加1 : 1 000 HRP標(biāo)記的 IgG于室溫反應(yīng)1 h;0 1%TBST再次洗膜后ECL顯色。所得結(jié)果以Actin為參照，應(yīng) 用Image pro plus5 1軟件進(jìn)行圖像分析，以與Actin吸光度的比值來(lái)表示其相對(duì)含量。1 6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料采用x主表示，同一鼠齡組內(nèi)各處理組間差異比較采用 單因素方差分析，相同處理的兩鼠齡組間比較采用t檢驗(yàn)和協(xié)方差分析。以相同鼠

12、齡 的LT組較L組表達(dá)的增加量為變量，進(jìn)行t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)軟件采用Stata 4 Q2結(jié)果21青年和老年大鼠肺組織纖維蛋白沉積水平變化肺組織纖維蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見(jiàn)圖1,定量分析結(jié)果見(jiàn)圖2。青年鼠和老年鼠NC組肺組織內(nèi)均無(wú)纖維 蛋白沉積；經(jīng)LPS刺激后，青年鼠肺組織內(nèi)出現(xiàn)少量的纖維蛋白沉積，而老年鼠肺組織內(nèi)纖維蛋白沉積重于青年鼠（19 3%出3%、11 6%±2 4%,P<0 05而在LT組,青年鼠和老 年鼠肺組織纖維蛋白沉積均較同鼠齡的 L組明顯加重（P<0 01并且老年鼠重于青年 鼠（33 5%± 7%、23 1%±4 6%,P<0 05同

13、鼠齡L TU組的纖維蛋白沉積較LT組均明 顯減輕（P<0 01。纖維蛋白廣泛沉積在肺血管、肺泡內(nèi)和肺間質(zhì)中圖1肺組織纖維蛋白免疫組化染色（>400（略2 2青年和老年大鼠肺組織ICAM 1蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)的變化各組大鼠ICAM 1蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)的變化和定量分析結(jié)果如圖 3、圖4顯示,蛋白質(zhì)和 mRNA的變化趨勢(shì)相同。青年鼠和老年鼠 NC組肺組織有很少量的ICAM 1表達(dá);L 組I CAM 1表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0 05加用氨甲環(huán)酸后,TL組表達(dá)較L組明顯上調(diào)（P<0 01;給尿激酶后ICAM 1表達(dá)較TL組顯著減少（P<0 05;老年鼠各干預(yù)組I CAM

14、1的 表達(dá)均高于相應(yīng)的青年鼠（P<0 05。經(jīng)纖維蛋白沉積量校正，老年大鼠各干預(yù)組 I CAM 1的表達(dá)仍顯著高于相應(yīng)青年大鼠（P<0 05。2 3青年和老年大鼠肺組織PAI 1蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)的變化各組大鼠PAI 1 蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)的變化和定量分析結(jié)果如圖 5、圖6顯示,PAI 1蛋白質(zhì)和 mRNA的變化趨勢(shì)與ICAM 1相同。圖2肺組織纖維蛋白沉積定量分析（略圖3各組ICAM 1蛋白質(zhì)水平表達(dá)變化（略圖4各組ICAM 1基因水平表達(dá)變化（略圖5各組PAI 1蛋白質(zhì)水平表達(dá)變化（略圖6各組PAI 1基因水平表達(dá)變化（略2 4青年和老年大鼠肺組織TM蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)的

15、變化各組大鼠TM 1蛋 白質(zhì)和mRNA表達(dá)的變化和定量分析結(jié)果如圖 &圖7顯示,蛋白質(zhì)和mRNA的變 化趨勢(shì)相同。青年鼠和老年鼠 NC組肺組織TM表達(dá)豐富;L組和LT組TM幾乎無(wú) 表達(dá)（P<0 01給尿激酶后TM表達(dá)較TL組顯著上調(diào)（P<0 05;老年鼠NC組和LTU組 TM的表達(dá)均低于相應(yīng)的青年鼠（P<0 05。圖7各組TM蛋白質(zhì)水平表達(dá)變化（略圖8各組TM基因水平表達(dá)變化（略3討論肺組織內(nèi)大量纖維蛋白沉積是急性肺損傷的重要病理特征1,5。纖維蛋白 除了具有破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致血管通透性增強(qiáng)和強(qiáng)烈抑制肺泡表面活性物質(zhì) 活性等直接損傷作用外6,7，體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)能

16、夠損傷內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)，但 其在體內(nèi)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用尚不清楚。本研究欲從體內(nèi)水平觀察纖維蛋白沉積對(duì)不 同鼠齡大鼠肺組織內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響。本研究選取了 TM、ICAM 1、PAI 1 3種特異性的分子標(biāo)志物作為監(jiān)測(cè)內(nèi)皮細(xì) 胞功能的指標(biāo)。TM主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，在肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)最高8。它是血液中最主要的抗凝物質(zhì)，與凝血酶結(jié)合成復(fù)合物，使凝血酶活性喪失。 內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷時(shí)，TM從細(xì)胞表面脫落喪失活性。ICAM 1是內(nèi)皮細(xì)胞表面的一 種黏附分子，介導(dǎo)白細(xì)胞、血小板與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷 時(shí),ICAM 1表達(dá)會(huì)顯著增多9。PAI 1是由內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等

17、合 成和分泌,PAI 1可與t PA形成1 : 1比例的復(fù)合物，從而抑制了 t PA的活性,減少纖 維蛋白的溶解。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損,PAI 1表達(dá)升高10。本研究結(jié)果表明，單純給予脂多糖誘導(dǎo)青年鼠和老年鼠肺組織纖維蛋白沉積 后,TM表達(dá)顯著下調(diào),ICAM 1和PAI 1表達(dá)顯著增加；給予脂多糖并使用纖溶抑制劑 氨甲環(huán)酸后，不論青年鼠還是老年鼠肺組織纖維蛋白沉積明顯增多，同時(shí)ICAM 1和PAI 1表達(dá)增加更加顯著；當(dāng)使用尿激酶處理后，肺組織纖維蛋白沉積明顯減少,TM 表達(dá)顯著上調(diào),ICAM 1和PAI 1表達(dá)顯著降低。這些結(jié)果提示，在炎癥刺激程度相同 的情況下，藥物調(diào)控纖維蛋白沉積水平能夠影響內(nèi)

18、皮細(xì)胞功能，即纖維蛋白在體內(nèi)具有內(nèi)皮細(xì)胞損傷作用。因此，在急性炎癥過(guò)程中，減少纖維蛋白的沉積對(duì)減輕炎癥病 理?yè)p傷有益。本研究還發(fā)現(xiàn)，相同干預(yù)組老年大鼠肺組織纖維蛋白沉積均較青年鼠顯著，提示增齡可促進(jìn)急性肺損傷肺組織纖維蛋白的沉積。此外通過(guò)纖維蛋白沉積變化量校正 我們發(fā)現(xiàn)各青年干預(yù)組肺組織ICAM 1和PAI 1的基因及蛋白質(zhì)的表達(dá)與老年鼠比 較仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別，提示在相同纖維蛋白沉積水平下，纖維蛋白對(duì)老年鼠內(nèi)皮 細(xì)胞功能的損傷作用更強(qiáng)，即增齡可促進(jìn)纖維蛋白的內(nèi)皮損傷作用。因此，在老年個(gè) 體肺部急性炎癥時(shí)，減少纖維蛋白沉積可能會(huì)減輕肺組織的炎癥損傷?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1金倩;氯地酊聯(lián)合激光治療座瘡158例療效觀察J;廣東醫(yī)學(xué);1997年10期2董新亭，李衛(wèi)莉，張隨學(xué)；自擬粉刺消治療座瘡126例J;中國(guó)中醫(yī)藥科技;1999 年06期3查旭山，陳修飏;尋常座瘡治療體會(huì)J;江西中醫(yī)藥; 年 05 期4張隨學(xué)，譚正輝,孫葉梅,李梅,俞玉芳，韓峰;3003例座瘡患者特征分析與控制對(duì) 策J;中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志； 年 06 期5劉勇，王冬梅;座瘡的藥物治療J；臨床醫(yī)藥實(shí)踐雜志；2003年09期6高宜云;座瘡從肝論治J;中醫(yī)藥臨床雜志