超聲波提取連翹葉總黃酮與總酚酸的實驗研究

1、    超聲波提取連翹葉總黃酮與總酚酸的實驗研究作者：田粟 唐龍妹 許麗琴 丁月新 劉汝俊 馬莉 薛鵬【摘要】  目的確定實驗室超聲波提取連翹葉總黃酮、總酚酸的最佳處理條件。方法采用正交設計法對甲醇濃度（A）、超聲時間（B）、提取次數(shù)（C）和提取溫度（D）4個因素進行考察，確定最優(yōu)超聲提取條件。結果因素D和C對測定指標均有顯著性影響，因素A、B為不顯著因素。結論以60%甲醇，超聲時間10 min/次，提取3次，提取溫度45 為最佳超聲提取條件。 【關鍵詞】  連翹葉； 總黃酮； 總酚酸； 正交實驗； 超聲提取Abs

2、tract：ObjectiveTo ascertain the optimal ultrasonic condition for extraction of total flavonoids and total phenolic acids from Forsythia suspense leaves by orthogonal design. MethodsIn the method of orthogonal test, methanol concentration (60%, 70%, and 80%), ultrasonic time (10 min, 15 min and 20 mi

3、n), extraction times (1, 2, and 3) and extraction temperature (5 , 25 , and 45 ) were analyzed, and the best ultrasonic condition was decided.ResultsExtraction temperature and extraction times had significant effect on either total flavonoids and total phenolic acids contents, methanol concentration

4、 and ultrasonic time were unsignificant factors. ConclusionUltrasonic with 20 fold 60% methanol and three times (10 min each time) at 45 was the optimal condition for extraction of total flavonoids and total phenolic acids from Forsythia suspense leaves.Key words：Forsythia suspense leaves; Total fla

5、vonoids; Total phenolic acids; Orthogonal design; Ultrasonic extraction連翹Forsythia suspense（Thunb.）Vahl作為傳統(tǒng)的中草藥，通常是以果實入藥，具有清熱解毒、消腫散結之功效1。在我國的河北和陜西等地，特別是在河北武安縣的長壽村，使用連翹葉泡茶飲用是當?shù)厝藗円恢毖永m(xù)至今的生活習慣。朱淑云等24研究了陜西產(chǎn)連翹葉沸水粗提取物的抗氧化、抗衰老作用。因此有人推測，武安縣的長壽現(xiàn)象可能與連翹葉的清除自由基、抗氧化和延緩衰老作用有關。大量的研究證實多酚類化合物具有良好的清除自由基效果及較強的抗氧化能力5。超聲

6、波提取因其獨特的提取機制及優(yōu)于常規(guī)法的提取效果，在中藥化學成分的提取中顯示出明顯的優(yōu)勢。但是到目前為止，尚未見超聲技術應用于提取連翹葉多酚的研究報道。本實驗以酚酸及黃酮類化合物為焦點，探討了不同溶劑對提取連翹葉總黃酮、總酚酸的影響，進而采用正交設計法對甲醇濃度、超聲提取時間、提取次數(shù)以及提取溫度4個因素進行實驗，確定了實驗室分析連翹葉中抗氧化成分的超聲最佳提取條件并測定了總黃酮、總酚酸含量。1 材料與儀器 連翹葉采摘自河北醫(yī)科大學校園內(nèi)，經(jīng)本校藥學院生藥教研室鑒定為木犀科植物連翹Forsythia suspense (Thunb.) Vahl的新鮮葉子。實驗前拭凈葉面，34 干燥24 h，粉碎

7、過篩后（40目）備用。752N 型紫外可見分光光度儀（上海精密 科學 儀器有限公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。蕓香葉苷，即蘆?。⊿CRC國藥集團化學試劑有限公司）；沒食子酸（日本和光公司）；其他試劑均為分析純。2 方法與結果 2.1 總黃酮含量測定方法2.1.1 標準曲線的制備 精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品20.0 mg， 置10 ml 量瓶中，加甲醇溶解定容，搖勻，得濃度為2 mg /ml的蘆丁標準溶液。精確移取蘆丁的標準品溶液0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 ml分別置于10 ml量瓶中，用甲醇補足1 ml。加入蒸餾水4 ml，混

8、合放置5 min后，加5% 亞硝酸鈉溶液0. 3 ml和10% 氯化鋁溶液0. 3 ml，搖勻，放置6 min，加1 mol/L氫氧化鈉溶液 2 ml后, 用水定容至10 ml, 充分混合。510 nm處測定吸光度，以吸光度A（Y）與濃度C（X）進行直線回歸，得回歸方程為Y = 1.096 3X + 0.067 7，r = 0.999 9。在0.01 0.06 mg /ml線性關系良好。2.1.2 樣品溶液測定精密取適當量的以下所得各樣品原液置于10 ml 量瓶中，用甲醇補足1 ml，搖勻，作為供試品溶液。按標準曲線制備項下操作，測定總黃酮含量。2.2 總酚酸含量測定方法2.2.1 標準曲線的

9、制備 精密稱取沒食子酸對照品18.8 mg，置100 ml 量瓶中，加甲醇溶解定容，搖勻，得濃度為1 mmol/L的沒食子酸標準溶液。精確移取沒食子酸的標準品溶液0.015，0.030，0.045，0.060，0.075，0.090 ml分別置于3 ml離心管中，用甲醇補足0.5 ml。加入Folin - Ciocalteu試劑1 ml，混合放置3 min，加7.5% 碳酸鈉溶液1 ml，搖勻，放置90 min，10 000 r/min離心10 min，750 nm處測定吸光度，以吸光度A（Y）與濃度C（X）進行直線回歸，得回歸方程為Y = 16.229X + 0.07，r = 0.999 9

10、。在1.1 × 103 6.8 × 103 mg/ml內(nèi)線性關系良好。2.2.2 樣品溶液測定 精密取適當量的以下各樣品原液置于3 ml 離心管中，用甲醇補足0.5 ml，搖勻，作為供試品溶液。按標準曲線制備項下操作，測定總酚酸含量。2.3 提取溶液的選擇精密稱取連翹葉粉末0.50 g，18份，置于50 ml離心管中，分別加入5 ml石油醚進行脫色脫脂處理，3 000 r/min離心，棄去醚液，重復進行兩次后，將濾渣中的石油醚揮發(fā)干燥。分別加10 ml沸水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、正己烷分3次超聲提取，20 min/次， 3 000 r/min離心，收集上清液減壓濃縮至

11、干。殘渣用適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為樣品原液置于-18 冰箱保存。稀釋至適當濃度后，用于測定總黃酮、總酚酸含量。結果見表1。表1 不同提取溶劑提取總黃酮、總酚酸含量的測定結果（略）從不同提取溶劑提取總黃酮、總酚酸含量的測定結果來看，甲醇提取物的總黃酮、總酚酸含量最高，說明甲醇提取連翹葉多酚成分的效果最好，故本研究選擇甲醇作為提取溶劑。2.4 超聲提取條件的確定2.4.1 正交實驗設計選用L9(34)正交表，每次實驗重復3次，考察甲醇濃度（A）、超聲時間（B）、提取次數(shù)（C）和提取溫度（D）等因素對提取總黃酮、總酚酸的影響。見表2。表2 實驗因素水平（略）2.

12、4.2 實驗與結果 精密移取各樣品原液0.04 ml置于10 ml 量瓶中，用甲醇補足1 ml，搖勻，作為供試溶液，測定總黃酮含量。精密移取濃度為5 mg/ ml各樣品溶液500 l置于3 ml 離心管中，作為供試溶液，測定總酚酸含量。結果見表3，SPSS軟件數(shù)據(jù)處理的方差分析見表4。表3 正交實驗方案及結果（略）每列數(shù)據(jù)中字母相同的結果之間沒有顯著性差異（P>0.05）表4 方差分析（略）通過方差分析表可知，超聲次數(shù)（C）及超聲溫度（D）對總黃酮含量有顯著性影響，甲醇濃度（A）及超聲時間（B）對實驗均沒有顯著意義，影響次序依次為D CB A。4種因素對總酚酸含量測定結果都有顯著性影響，

13、其中D和C為關鍵因素，對實驗影響較大，影響次序為DC A B。經(jīng)兩兩比較可知（見表3），這2個考察指標的最佳超聲處理條件都為A1B1C3D3，即甲醇濃度為60%，超聲時間10 min/次，提取3次，超聲溫度為45 。2.5 連翹葉總黃酮、總酚酸含量的測定按上述確定的超聲提取條件進行連翹葉的超聲提取實驗，操作方法同前述，測定結果見表5。表5 驗證實驗結果（略）連翹葉中總黃酮含量為153 mg/ g，總酚酸含量為41.1 mg/ g。經(jīng)檢驗與正交實驗方案中得到最好結果的A1B3C3D3組比較沒有顯著性差異。這與SPSS軟件數(shù)據(jù)處理中因素B兩兩比較后顯示的第1水平和第3水平之間沒有顯著意義的結果一致

14、?？紤]到超聲時間為不顯著因素，為了提高實驗效率，最終選擇了超聲提取條件為A1B1C3D3，且該提取方法是穩(wěn)定可行的。3 討論 作為資源更為豐富的連翹葉，其茶制品的抗氧化、抗衰老作用越來越受到關注，且研究表明連翹葉中有效成分的含量遠遠高于果實6。酚酸和黃酮類成分是植物中廣泛存在的抗氧化物質(zhì)，甲醇、乙醇、丙酮和二甲亞砜被報道是最常用的實驗室提取多酚類成分的有機溶劑，而甲醇水溶液是使用最頻繁的7。根據(jù)有關 文獻 報道8，9及本研究結果，確定了甲醇是提取連翹葉中酚酸及黃酮類成分的最適溶劑。己烷提取物和醋酸乙酯提取物因在甲醇中的溶解性差而表現(xiàn)出較低的總黃酮、總酚酸含量。近些年，因為超聲輔助提取具有快捷、

15、 經(jīng)濟 、效率高等優(yōu)點而被廣泛應用于分析化學領域中。張華峰等10的研究揭示超聲輔助提取減小了淫陽藿葉子樣品的顆粒大小，且可以促進溶劑對葉子樣品的浸透以及樣品細胞中分析物的釋放，而表現(xiàn)出優(yōu)于沸水提取和索氏提取的效果。本研究通過正交實驗確定了實驗室超聲提取連翹葉總黃酮、總酚酸條件，結果證明最佳提取條件是用20倍量60%甲醇做溶劑，45 下超聲提取3次，10 min/次，總黃酮含量為153 mg/ g，總酚酸含量為41.1 mg/ g。另外，因為其他因素相同、超聲時間為10 min和20 min這兩組實驗的結果沒有呈現(xiàn)出顯著性的差異。為了提高效率和避免超聲時間過長可能造成部分成分有所損失，所以在以后

16、的研究中超聲提取時間選擇10 min。此方法的確定不僅為進一步深入地解析連翹葉的抗氧化、抗衰老成分提供了快捷有效的提取手段，而且對合理地利用和開發(fā)連翹葉資源具有 參考 意義?！緟⒖嘉墨I】 1 國家藥典委員會. 中國 藥典,部S.北京:化學 工業(yè) 出版社, 2005：117.2 朱淑云,楊建雄,李發(fā)榮. 連翹葉提取物對小鼠氧化損傷的保護作用J. 中藥藥理與臨床, 2004, 20 (1): 18.3 楊建雄,李發(fā)榮,朱淑云. 連翹葉茶的體外抗氧化活性J. 食品 科學 , 2002, 23 (12): 120. 4 侯改霞,李發(fā)榮,劉 靜,等. 連翹葉茶抗氧化抗衰老作用的實驗研究J. 營養(yǎng)學報,

17、2004,26 (1): 65. 5 Cook N C, Samman S. Flavonoids-chemistry, metabolism, cardioprotective effects, and dietary sources J. Nutr Biochem, 1996, 7: 66.6 李發(fā)榮,段 飛,楊建雄. 中藥連翹及連翹葉中連翹苷含量的比較研究J. 西北植物學報,2004,24（4）：725.7 Harnly JM, Bhagwat S, Lin LZ. Profiling methods for the determination of phenolic compounds

18、 in food and dietary supplementsJ. Anal Bioanal Chem, 2007, 389: 47.8 Zou YP, Lu YH, Wei DZ. Antioxidant activity of a flavonoid-rich extract of Hypericum perforatum L. in vitro J. J Agric Food Chem, 2004, 52: 5032. 9 Guo H, Liu AH, Li L, et al. Simultaneous determination of 12 major constituents in Forsythia suspensa by high perform