草珊瑚總黃酮提取及含量檢測(cè)

1、草珊瑚總黃酮提取及含量檢測(cè)【摘要】目的 研究草珊瑚總黃酮的提取工藝。方法 以草珊瑚為原料，用乙醇為溶劑，利用超聲波輔助提取和水浴法提取草珊瑚總黃酮，利用L9（33 ）正交實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化總黃酮提取工藝，采用單因素實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度等單因素實(shí)驗(yàn)，考察總黃酮提取率與各因素的關(guān)系。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得出的顯著條件進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，確定最佳工藝條件。結(jié)果 超聲波法的最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比115、提取時(shí)間45 min，根據(jù)確定的最佳工藝條件，按實(shí)驗(yàn)中的測(cè)定方法測(cè)得提取的總黃酮含量為69.25 mg/g。水浴法的最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比120、提取溫度80 、提

2、取時(shí)間2 h，按實(shí)驗(yàn)中的測(cè)定方法測(cè)得提取的總黃酮含量49.60 mg/g。結(jié)論 超聲波提取不僅在時(shí)間上比水浴提取大大縮短，而且實(shí)驗(yàn)過程易于控制，黃酮提取率也比水浴提取提高28.38%。 【關(guān)鍵詞】 草珊瑚；總黃酮；提取工藝；含量Content detection and extraction of total flavonoids in sarcandra glaber FAN Jia-you,YU Jian-ping,LIU Jian.Life Science Institution of Guizhou University,Guiyang 550025,China Abstract Ob

3、jective To optimize the extraction process of the flavonoids from sarcandra glaber.Methods Used sarcandra glaber as raw materials，took ethanol extraction methods and used ultrasonic water bath to extract the flavonoids，then used L9（33） orthogonal experiment to optimize the extraction process of flav

4、onoids.One of the experiments is the single factor experiment.According to the given conditions and measured flavones，what we will do is to have single factor experiments about different concentrations of ethanol，feed ratio，extraction time and temperature.According to the remarkable conditions from

5、single factor experiments，we will have an orthogonal design and then select the best conditions.Results The optimum conditions of ultrasonic methods are for the concentration of 50 percent ethanol，feed rate 115，the extracted time 45 minutes，the flavones in 69.25 mg/g.The optimum conditions of water

6、bath for ethanol methods are for concentration of 50 percent，feed rate 120，the extracted temperature 80 and the flavones in 49.60 mg/g.Conclusion The time used in ultrasonic extraction is greatly shorter than that of water bath and the experiment is easier to control than that of water bath，and the

7、extraction rate of flavonoids also raise 28.38% than that of water bath. Key words sarcandra glaber；flavonoids；extraction process；content 隨著草珊瑚在醫(yī)藥、獸藥、保健食品及保健用品領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛，對(duì)其有效成分的提取分離顯得越來越重要。黃酮類化合物是草珊瑚中含量最多、最主要的活性成分之一。目前，對(duì)草珊瑚總黃酮的提取分離工藝技術(shù)研究尚未見有詳細(xì)報(bào)道，本學(xué)位論文擬對(duì)草珊瑚總黃酮提取分離工藝技術(shù)進(jìn)行較系統(tǒng)的研究并篩選最佳新技術(shù)新工藝。采用正交實(shí)驗(yàn)方法考察沸水

8、提取法及乙醇提取法對(duì)草珊瑚總黃酮提取效果的影響；采用中藥高新工程技術(shù)大孔吸附樹脂對(duì)草珊瑚總黃酮進(jìn)行分離純化研究，以確定草珊瑚總黃酮最佳提取分離工藝條件及方法。以確定的草珊瑚總黃酮最佳提取工藝對(duì)不同季節(jié)采收的草珊瑚中總黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化，草珊瑚自然存放時(shí)間不同對(duì)總黃酮含量的影響，貴州草珊瑚根、莖、葉中總黃酮的不同含量進(jìn)行動(dòng)態(tài)變化研究，以確 定草珊瑚原料的最佳利用時(shí)機(jī)。從而為生產(chǎn)中最有效的開發(fā)利用草珊瑚，獲得草珊瑚總黃酮的最大提取率，發(fā)揮草珊瑚的最大經(jīng)濟(jì)效益提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及指導(dǎo)，以達(dá)到提升草珊瑚藥、食用產(chǎn)品的質(zhì)量檔次，使其更具三效（高效、速效、長(zhǎng)效），三?。▌┝啃?、毒性小、不良反應(yīng)小），三便（便于貯

9、藏，便于攜帶，便于服用）的特點(diǎn)，使其產(chǎn)品能走出國門、出口創(chuàng)匯，有著重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義1。 1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 原料：草珊瑚購于貴陽花果園藥材市場(chǎng)；NaNO2（固體）（重慶北碚精細(xì)化工廠）；95%的乙醇溶液（分析純） （遵義國營(yíng)化學(xué)試劑廠）；Al（NO3）3（固體）（匯源化工有限公司）；NaOH（固體）（天津市化學(xué)試劑六廠三分廠）。 1.2 實(shí)驗(yàn)器材 HH-S2s型恒溫水浴鍋（金壇市環(huán)保儀器廠）；UV2755B紫外可見分光光度計(jì)（上海分析儀器總廠）；抽濾機(jī)（金宇機(jī)械有限公司）；JY88（96）-IIN型數(shù)控超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；FA1004型電子分析天平（

10、上海天平儀器廠）。 1.3 實(shí)驗(yàn)方法 1.3.1 黃酮類化合物的超聲波法提取研究 超聲波提取方法：取原料草珊瑚5 g按實(shí)驗(yàn)要求的料液比加入乙醇，放入準(zhǔn)備好的燒杯中，超聲波提取，抽濾液體，取0.3 ml加入25 ml容量瓶中，再在25 ml容量瓶中加入1 ml 5%的NaNO2溶液，等待6 min后，再在25 ml容量瓶中加入0.5 ml 5%的Al（NO3）3溶液，等待6 min后，再在25 ml容量瓶中加入10 ml 5% NaOH溶液，并加入60%乙醇溶液定容。等待15 min后在500 nm處檢測(cè)吸光度，然后記錄數(shù)據(jù)做空白對(duì)比的不加Al（NO3）3。 超聲波提取過程：（1）稱取草珊瑚5

11、g分別裝入準(zhǔn)備好了的燒杯中，在燒杯上填上編號(hào)，并記錄好數(shù)據(jù)。（2）用95%乙醇分別配制50%、60%、70%、80%的乙醇，按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)搭配裝入對(duì)應(yīng)號(hào)的錐形瓶中。（3）根據(jù)以上配置好的原料，放入超聲波儀器中進(jìn)行提取。（4）將以上提取物過濾，將濾液按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)出吸光度，并記錄好數(shù)據(jù)。 1.3.2 黃酮類化合物的水浴提取研究 取原料草珊瑚5 g 按實(shí)驗(yàn)要求的料液比加入乙醇，放入錐形瓶中，水浴鍋加熱，抽濾液體，取0.3 ml加入25 ml容量瓶中，再在25 ml容量瓶中加入1 ml 5%的NaNO2的乙醇溶液，等待6 min后，再在25 ml容量瓶中加入0.5 ml 5%的Al（NO3）3的乙醇

12、溶液，等待6 min后，再在25 ml容量瓶中加入10 ml 5% NaOH的乙醇溶液，并加入60%乙醇溶液定容。等待15 min后在500 nm處檢測(cè)吸光度，然后記錄數(shù)據(jù)作空白對(duì)比的不加Al（NO2）3。 水浴提取的實(shí)驗(yàn)過程為：（1）稱取草珊瑚5 g分別裝入準(zhǔn)備好了的錐形瓶中，在錐形瓶上填上編號(hào)，并記錄好數(shù)據(jù)；（2）用95%乙醇分別配制50%、60%、70%、80%的乙醇，按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)搭配裝入對(duì)應(yīng)號(hào)的錐形瓶中，并用保鮮膜密封好；（3）把錐形瓶放入已準(zhǔn)備好的一定溫度的水浴中加熱，2 h后取出抽濾液體轉(zhuǎn)入干凈的燒杯中，并用保鮮膜密封好；（4）將以上的提取物過濾，將濾液按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)出吸光度，并

13、記錄好數(shù)據(jù)。 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 見圖1。從蘆丁對(duì)照儲(chǔ)備液中分別吸取1 ml，放入1號(hào)、2號(hào)容量瓶中（25 ml），各加60 %乙醇至5 ml，加5%NaNO2溶液1.0 ml，搖勻放置6 min，再加10%Al（NO3）3 溶液0.5 ml（空白對(duì)照不加），搖勻再放置6 min，加4%NaOH溶液10 ml，搖勻放置15 min，從400600 nm處測(cè)吸光值：可得出蘆丁在500 nm處存在最大吸收峰。 回歸方程：A=0.0095C+0.0016,線性范圍為059.82 g/ml，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991 圖1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 首先，精密稱取蘆丁對(duì)照品18.6 mg，

14、置于100 ml量瓶中，加60%乙醇溶解至刻度，搖勻即得對(duì)照品溶液。然后，分別精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0和5.0、6.0、7.0、8.0 ml對(duì)照品溶液置于25 ml容量瓶中，各加60 %乙醇至5 ml，加5%NaNO2溶液1.0 ml，搖勻放置6 min，再加10%Al（NO3）3 溶液0.5 ml，搖勻再放置6 min，加4%NaOH溶液10 ml，搖勻放置15 min，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以同法配制空白（不加硝酸鋁）對(duì)照。顯色劑的配置：含量測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。所用試劑均為分析純，4%NaOH乙醇溶液（200 ml）： 稱取8 g NaOH置入燒杯中，用200

15、ml 60%乙醇溶解。10% Al（NO3）3乙醇溶液（25 ml）：稱取2.5 g Al（NO3）3置于燒杯中，用25 ml 60%乙醇溶解。5%NaNO2乙醇溶液（50 ml）：稱取2.5 g NaNO2置于燒杯中，用50 ml 60%乙醇溶液溶解2。 2.2 黃酮提取過程 2.2.1 提取方法 （1）超聲波提?。壕芊Q取干燥、粉碎的草珊瑚粉末5 g置于燒杯中，按實(shí)驗(yàn)要求的料液比加入乙醇溶液浸泡，然后用超聲波提取。 （2）水浴法提?。壕芊Q取干燥、粉碎的草珊瑚粉末 5 g 置于錐形瓶中，按實(shí)驗(yàn)要求的料液比加入乙醇溶液浸泡并用保鮮膜密封好，然后放在水浴鍋上加熱2 h，濾去殘?jiān)?2.2.2

16、樣品測(cè)定 精密吸取黃酮提取液 0.3 ml于25 ml容量瓶中，分別加入60%的乙醇6 ml，再加入5% NaNO2 1.0 ml，搖勻放置6 min，加入10%Al（NO3）30.5 ml（做空白對(duì)照的不加），搖勻放置6 min，加入4%NaOH 10.0 ml，加入60%的乙醇定容至刻度。搖勻放置15 min在500 nm處測(cè)吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算出濃度。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A=0.0095C + 0.0016，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程可以推導(dǎo)出C=（A-0.0016）/0.0095，C為物質(zhì)濃度（單位為g/ml），提取黃酮的質(zhì)量（mg）=C25/310V10-3,

17、提取總黃酮含量=提取黃酮的質(zhì)量（mg）/原料草珊瑚質(zhì)量（g）。 2.3 超聲波法提取黃酮的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 2.3.1 乙醇濃度對(duì)超聲波法提取效果的影響 在五個(gè)燒杯中各取5 g草珊瑚放入，分別用40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液50 ml浸泡后超聲波萃取15 min，按以上的含量測(cè)定方法測(cè)定吸光度值。見表1。表1表明：隨著乙醇濃度的增加，黃酮的提取率也逐漸增加，但是當(dāng)乙醇濃度超過60%的時(shí)候，黃酮的提取率反而降低，是因?yàn)殡S著乙醇濃度的增大，會(huì)使提取粗品中雜質(zhì)含量增加，黃酮成分含量反而降低。表1 乙醇濃度對(duì)草珊瑚黃酮提取的影響 2.3.2 料液比對(duì)黃酮提取效果的影響

18、在四個(gè)燒杯中各取5 g草珊瑚放入，用60%的乙醇，料液比分別15、110、115、120浸泡后超聲波萃取15 min，按含量測(cè)定方法測(cè)定吸光度值。見表2。表2 料液比對(duì)草珊瑚黃酮提取的影響表2可見，浸提固液比在110至120的范圍內(nèi)，浸提固液比在115時(shí)提取率最高，但隨后增加溶劑的量對(duì)提取率的變化不大，在實(shí)際操作中，當(dāng)浸提固液比過小時(shí)，提取液偏少，不利于過濾分離，因此選擇浸提固液比在115較為合適。 2.3.3 超聲波萃取時(shí)間對(duì)黃酮提取效果的影響 在四個(gè)燒杯中各取5 g草珊瑚放入，在料液比110，60%乙醇條件下選擇時(shí)間分別為15 min、30 min、45 min、60 min進(jìn)行超聲波萃取

19、，按含量測(cè)定方法測(cè)定吸光度值。見表3。 表3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取的影響由表3可見，隨超聲波提取時(shí)間1530 min，吸光度增長(zhǎng)0.046，增長(zhǎng)程度一般，而提取時(shí)間3045 min時(shí)，吸光度增加了0.102，幅度大增，而提取時(shí)間4560 min時(shí)，吸光度增長(zhǎng)了0.012，增長(zhǎng)程度大大降低。由此可以看出，再增加超聲波提取時(shí)間，吸光度增速出現(xiàn)先增強(qiáng)再逐漸減緩趨勢(shì)。造成提取物在超聲作用達(dá)到一定時(shí)間后，提取率增加緩慢或呈下降趨勢(shì)的原因可能是在長(zhǎng)時(shí)間超聲作用下，提取率逐漸向極限值靠近，致使提取率增幅降低。同時(shí)超聲作用時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)使提取粗品中雜質(zhì)含量增加，有效成分含量反而降低，影響提取物有效含量。故45 m

20、in提取時(shí)間是最好的工藝條件。 由以上單因素實(shí)驗(yàn)可得出幾個(gè)在實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著作用的因素，他們分別是乙醇濃度 50%、60%、70%，料液比110、115、120，提取時(shí)間15 min、30 min、45 min，運(yùn)用這些條件做出提取工藝參數(shù)設(shè)計(jì)表（表4），為下面的正交實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備條件。見表5、6。 由表5可看出R料液比R乙醇濃度R提取時(shí)間，所以本實(shí)驗(yàn)料液比作為主要因素，K1、K2、K3中數(shù)據(jù)最大者對(duì)應(yīng)的水平為最佳水平，即轉(zhuǎn)化率最高。本實(shí)驗(yàn)的最佳水平組合是A1B2C3，即最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比115、提取時(shí)間45 min。表4 提取工藝參數(shù)設(shè)計(jì)表表5 L9（33）提取工

21、藝條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表表6 最佳工藝條件提取由表6可看出黃酮含量 69.25 mg/g，比正交實(shí)驗(yàn)中的A1B2C2（乙醇濃度50%、料液比115、提取時(shí)間30 min）所提取出的黃酮含量還高，證明本次正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)論是合理的。 2.4 水浴法提取黃酮的單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 2.4.1 乙醇濃度對(duì)水浴法提取效果的影響 在四個(gè)錐型瓶中各取5 g草珊瑚放入，分別用50%、60%、70%、80%乙醇溶液75 ml浸泡后，水浴提取2 h，按以上的含量測(cè)定方法測(cè)定吸光度值（表7）。表7 乙醇濃度對(duì)水浴法提取效果的影響由表7可看出：隨著乙醇濃度的增加，黃酮的提取率也逐漸增加，但從60%70%，吸

22、光度增長(zhǎng)幅度變小即提取的黃酮含量增長(zhǎng)幅度變小，當(dāng)乙醇濃度超過80%的時(shí)候，黃酮的提取率反而降低，提取的黃酮含量變小，是因?yàn)殡S著乙醇濃度的增大，會(huì)使提取粗品中雜質(zhì)含量增加，有效成分含量反而降低，影響提取物有效含量。 2.4.2 提取溫度對(duì)水浴法提取黃酮效果的影響 在四個(gè)錐形瓶中各取5 g草珊瑚放入，在料液比120，60%乙醇條件下選擇60 、70 、80 、85 進(jìn)行水浴法提取，按含量測(cè)定方法測(cè)定吸光度值（表8）。 由表8可看出在乙醇濃度60%、料液比120的不變條件下，隨著提取溫度的升高，吸光度值也在不斷的增長(zhǎng)，60 70 的增長(zhǎng)程度是最大的，吸表8 提取溫度對(duì)水浴法提取黃酮效果的影響光度增長(zhǎng)

23、最大，但隨著溫度的繼續(xù)升高，吸光度的增長(zhǎng)程度越來越小，是因?yàn)殡S著溫度的增加，提取出來的黃酮參與了其他的反應(yīng)，故提取的增長(zhǎng)率變小了（溫度也不易太高，體積將會(huì)大量減少）。 2.4.3 料液比對(duì)水浴法總黃酮提取效果的影響 在四個(gè)錐形瓶中按料液比各取草珊瑚放入，在提取溫度70 、乙醇濃度60%條件下選擇料液比分別為115、120、125、130進(jìn)行水浴法提取，按含量測(cè)定方法測(cè)定吸光度值（表9）。表9 料液比對(duì)水浴法總黃酮提取效果的影響表9可見，浸提固液比在115至120的范圍內(nèi)，吸光度最高，但隨后增加溶劑的量對(duì)吸光度的變化不大，在實(shí)際操作中，當(dāng)浸提固液比過小時(shí)，提取液偏少，不利于過濾分離，因此選擇浸提

24、固液比在120較為合適。 由以上單因素實(shí)驗(yàn)可得出幾個(gè)在實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著作用的因素，他們分別是乙醇濃度50%、60%、70%，料液比115、120、125，提取溫度60 、70 、80 ，運(yùn)用這些條件做出提取工藝參數(shù)設(shè)計(jì)表（表10），為下面的正交實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備條件，見表11、12。表10 提取工藝參數(shù)設(shè)計(jì)表表11 水浴法提取黃酮L9（33）實(shí)驗(yàn)表表12 最佳工藝條件確定表由表11可看出R料液比 R提取溫度R乙醇濃度，所以本實(shí)驗(yàn)料液比作為主要因素，K1、K2、K3中數(shù)據(jù)最大者對(duì)應(yīng)的水平為最佳水平，即轉(zhuǎn)化率最高。本實(shí)驗(yàn)的最佳水平組合是A1B2C3，即最佳工藝條件為乙醇濃度50%、料液比120、提取溫度80 。 由表12可看出黃酮含量49.60 mg/g，比正交實(shí)驗(yàn)中的A1B2C2（乙醇濃度60%、料液比120、提取溫度80 ）所提取出的黃酮含量還高，證明本次正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)論