當(dāng)歸注射液對缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞組織化學(xué)變化的影響

1、當(dāng)歸注射液對缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞組織化學(xué)變化的影響    【關(guān)鍵詞】 當(dāng)歸注射液；,缺血再灌注；,心??；,組織化學(xué) 摘 要： 目的：探討當(dāng)歸抗心肌缺血再灌注損傷保護作用的機理。方法:將45只SD大鼠隨機分成3組(每組n=15) :假手術(shù)組(組)，缺血再灌注組(組)，當(dāng)歸治療組(組) ,建立在體心肌缺血再灌注動物模型。實驗完畢后，將各組動物心肌組織做組織化學(xué)染色，觀察各組動物心肌細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶(SDH)活性。利用HPIAS2000圖像分析系統(tǒng)測定SDH在以上3組中表達的平均光密度和平均陽性面積率。結(jié)果：當(dāng)歸治療組心肌細(xì)胞中SDH反應(yīng)物呈顆粒狀,均勻分

2、布于肌膜下或肌絲區(qū)之間, 顆粒呈深紫色, 表示酶活性很強；假手術(shù)組酶反應(yīng)物呈淺紫色細(xì)小顆粒狀，肌膜下或肌絲區(qū)之間可見少量的紫色顆粒，分布較稀疏，表示酶活性較弱；缺血再灌注損傷組SDH反應(yīng)物極弱，幾乎未見酶活性表達。圖像分析結(jié)果顯示當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組和缺血再灌注損傷組之間平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01)；假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0 05)。結(jié)論：當(dāng)歸注射液對大鼠缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞有重要的保護作用。 關(guān)鍵詞： 當(dāng)歸注射液； 缺血再灌注； 心??； 組織化學(xué)    自1

3、977年Hearse首次提出缺血再灌注損傷概念以來，已逐漸引起醫(yī)學(xué)界的高度重視。大量動物實驗顯示，氧自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞、一氧化氮、中性粒細(xì)胞、細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞凋亡等均可能參與再灌注損傷的發(fā)病過程。缺血再灌注損傷對心肌組織的結(jié)構(gòu)和功能的影響一直是研究的重點之一。當(dāng)歸的藥用價值早已為人們所認(rèn)識, 從當(dāng)歸的乙醇提取物中分離到6種化合物分別為: (E)藁本內(nèi)酯, (Z)藁本內(nèi)酯, (Z)正丁基呋內(nèi)酯, 棕櫚酸, B2谷甾醇, 阿魏酸。此外還含有蔗糖、多種氨基酸及微量金屬元素、煙酸、丁二酸、腺嘌呤、尿嘧啶、膽堿等成分。當(dāng)歸的藥理作用主要是：促進機體免疫；對呼吸系統(tǒng)的作用

4、；對血液循環(huán)系統(tǒng)的作用，有文獻報道1。 當(dāng)歸對冠心病患者應(yīng)用當(dāng)歸注射液治療能平衡和抑制血小板聚集的作用，因而能明顯改善胸痛、胸悶等臨床癥狀和心電圖缺血性STT 的變化, 是治療冠心病的有效藥物2。當(dāng)歸具有鈣通道阻滯作用, 拮抗鈣超載, 對心肌缺血再灌注所致心肌損傷有保護作用。在缺血及再灌注狀態(tài)下, 心臟順應(yīng)性及射血功能得到良好的保護, 使反映心肌損傷程度的CPK 活性和氧自由基損傷過程產(chǎn)生的過氧化脂質(zhì)分解產(chǎn)物MDA 的濃度大大降低3。但當(dāng)歸對缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，目前國內(nèi)外未見報道。本研究采用組織化學(xué)方法，并利用HPIAS2000圖像分析系統(tǒng)測定SDH在以上3組中表達的平均光密度和

5、平均陽性面積率，探討當(dāng)歸抗心肌缺血再灌注損傷保護作用的機理。 1 材料與方法 11 動物模型制備及分組健康雄性SD大鼠（SPF級）45只,體重250300 g 左右，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物試驗中心提供。腹腔注射戊巴比妥鈉4.5 mg(100 g)-1 ,麻醉動物后行氣管切開接微型呼吸機人工呼吸呼吸頻率60 次min-1 ,潮氣量2ml(100g)-1,微型呼吸機由第二軍醫(yī)大學(xué)生產(chǎn) ,沿胸骨左緣第4 肋骨開胸在左心室、右心室與左心房交界處結(jié)扎/ 開放左冠狀動脈前降支建立心肌缺血再灌注模型。將動物隨機分成3組(每組n = 15):假手術(shù)組(組) ,絲線穿過冠狀動脈前降支但不結(jié)扎；缺血再灌注組( 組)

6、 ,缺血再灌注前5min 腹腔注射生理鹽水0. 8 ml(100 g)；當(dāng)歸治療組( 組),缺血再灌注前5min 腹腔注射當(dāng)歸注射液0.8 ml( 100g)-1 。每組5只動物缺血30min再灌注40min ,10只動物缺血30min 再灌注120min。在缺血再灌注開始前, 經(jīng)舌靜脈注射伊文氏藍(lán), 缺血40min后心尖無藍(lán)色且呈烏紅部分為缺血區(qū),再灌注120min 后心肌經(jīng)TTC處理后心尖為白色部分為梗死區(qū)。 12 主要試劑25%當(dāng)歸注射液由武漢大學(xué)中南醫(yī)院制藥廠提供,批號為970118。 13 標(biāo)本制作及觀察用Nachlas硝基四氮唑藍(lán)法顯示琥珀酸脫氫酶(SDH)活性。以上各組動物實驗完

7、畢后,將各組動物從心底部剪取心臟,切下心室。新鮮組織恒冷式切片，片厚10m。 入孵育液中，370C，1560分鐘    孵育液配法：0.2M磷酸緩沖液（pH7.6） 1份    0.2M的琥珀酸溶液    1份    NitroBT水溶液    2份 生理鹽水稍洗； 10%甲醛鹽水固定10分鐘； 15%酒精稍洗1分鐘； 生理鹽水稍洗； 甘油明膠封片。 14 圖像分析采用HPLAS2000高清晰度彩

8、色病理圖文報告管理系統(tǒng)對酶活性表達進行定量分析,每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(×400),測定SDH每個視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積,計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。 15 統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS11.5軟件對各組組織化學(xué)反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和(q)檢驗,檢驗水準(zhǔn)為0.05。    2 結(jié)果 21 光鏡觀察假手術(shù)組可見心肌細(xì)胞呈短圓柱狀，有分支，但可見部分胞漿溶解。缺血再灌注損傷組見心肌細(xì)胞呈短圓柱狀，有分支，胞漿溶解呈空泡或網(wǎng)狀，細(xì)胞界

9、限模糊，可見心肌細(xì)胞斷裂。當(dāng)歸治療組可見心肌細(xì)胞呈短圓柱狀，有分支，細(xì)胞核呈橢圓形位于中央，胞漿內(nèi)可見平行排列的肌原纖維，細(xì)胞輪廓清晰。 22 組織化學(xué)觀察 琥珀酸脫氫酶(SDH) 活性當(dāng)歸治療組心肌細(xì)胞中SDH反應(yīng)物呈顆粒狀,均勻分布于肌膜下或胞漿內(nèi), 顆粒呈深紫色, 表示酶活性很強。假手術(shù)組肌酶反應(yīng)物呈淺紫色細(xì)小顆粒狀，可見少量的紫色顆粒，分布較稀疏，表示酶活性較弱。缺血再灌注損傷組SDH反應(yīng)物極弱，幾乎未見酶活性表達，表示無酶活性表達。經(jīng)單因素方差分析,各組間的差異有顯著性意義(P<0.05)，見表1。 表1 當(dāng)歸注射液對大鼠缺血/再灌注損傷心肌細(xì)胞內(nèi)SDH活性影響的平均光密度和陽

10、性面積率(略)經(jīng)SNK()檢驗, 當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組和缺血再灌注損傷組之間SDH 活性的平均光密度及陽性面積率分別為：當(dāng)歸治療組平均光密度0.4625±0.0875；假手術(shù)組平均光密度0.2684±0.0076；缺血再灌注損傷組平均光密度0.2471±0.0021。當(dāng)歸治療組陽性面積率0.4448±0.0918； 假手術(shù)組陽性面積率0.1963±0.0824；缺血再灌注損傷組陽性面積率0.1841±0.0679。當(dāng)歸治療組與假手術(shù)組比較平均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01)；當(dāng)歸治療組與缺血再灌注損傷組比較平

11、均光密度及陽性面積率的差異有顯著性意義(P<0.01)；假手術(shù)組與缺血再灌注損傷組之間比較平均光密度及陽性面積率的差異無顯著性意義(P>0 05)。    3 討論 局部組織或器官缺血將導(dǎo)致組織或器官的損害，但隨著血供恢復(fù)，在隨后的一定時間內(nèi)組織或器官的損傷不僅不會減輕，反而逐漸加重，此即所謂的缺血再灌注損傷（ischemic reperfusion injury,IRI）。自1977年Hearse首次提出缺血再灌注損傷概念以來，已逐漸引起醫(yī)學(xué)界的高度重視。大量動物實驗顯示，氧自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、血管內(nèi)皮細(xì)胞、一氧化氮、中性

12、粒細(xì)胞、細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞凋亡等均可能參與再灌注損傷的發(fā)病過程。目前雖然對缺血或缺血再灌注損傷的確切機制還不十分清楚,但已經(jīng)知道損傷的臨床結(jié)局主要就是細(xì)胞死亡。細(xì)胞死亡有兩種形式:一種是壞死,另一種是凋亡。凋亡(apoptosis) 是細(xì)胞在基因調(diào)控下的主動性死亡,不引起炎癥反應(yīng)。持續(xù)缺血和缺血再灌注時心肌組織都可發(fā)生細(xì)胞凋亡。已經(jīng)證實,人類心肌梗死除細(xì)胞壞死外,細(xì)胞凋亡也參與了梗死的病理過程,細(xì)胞凋亡不僅影響梗死面積,而且促成心臟結(jié)構(gòu)的重構(gòu),心肌梗死的早期和晚期均存在凋亡現(xiàn)象4。再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡多分布于短暫缺血后血管再通的相關(guān)部位和梗死灶的收縮帶區(qū)域。有資料顯示,心肌梗死急性期的存活

13、心肌其Bcl2 表達增加,而慢性期Bax表達增加,說明刺激因子由Bcl2和Bax 基因產(chǎn)物來抑制或誘導(dǎo)存活的心肌細(xì)胞凋亡5。細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控是一個十分復(fù)雜的問題,尤其是相關(guān)基因的相互關(guān)系尚不十分清楚。缺血再灌注損傷對心肌組織的結(jié)構(gòu)和功能的影響一直是研究的重點之一。當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinennsis(Oliv.)Diels的干燥根，味甘、辛,性溫。當(dāng)歸能顯著延緩肌肉萎縮,增加肌肉組織SOD的含量,其機理可能與當(dāng)歸促進肌肉血液循環(huán)、改善代謝有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用當(dāng)歸注射液對更年期大鼠進行靜脈連續(xù)給藥20天后,血SOD活性明顯增高,脂質(zhì)過氧化物(LPO)水平下降,說明當(dāng)歸注射液可

14、清除氧自由基,抗脂質(zhì)過氧化物反應(yīng),對更年期大鼠心血管系統(tǒng)有重要的保護作用6，7。本實驗通過結(jié)扎/松解左冠狀動脈前降支復(fù)制心肌缺血再灌注模型，并用當(dāng)歸注射液預(yù)處理，結(jié)果顯示當(dāng)歸治療組心肌結(jié)構(gòu)正常，未受到破壞和影響，且心肌酶的活性很強。心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體含量豐富，構(gòu)成細(xì)胞容積的35%40%，含有大量催化三羧酸（TCAC）、氨基酸代謝、脂肪酸分解、電子傳遞以及能量轉(zhuǎn)換的酶和輔酶，LDH 、SDH則是其中的兩種酶。心肌脫氫酶學(xué)改變是心肌損害的早期有意義的指征，缺血心肌脫氫酶的缺失是不可逆性心肌損害的明確指標(biāo)8。我們的實驗也已證明了這一點。因此通過實驗表明：當(dāng)歸注射液預(yù)處理提高了心肌酶的活性并維持了細(xì)胞超

15、微結(jié)構(gòu)的完整性，對缺血再灌注心肌細(xì)胞有保護作用。從以上的實驗結(jié)果和討論來分析當(dāng)歸注射液為防治缺血再灌注損傷的應(yīng)用具有重要的研究意義，并且為加強心肌保護作用提供重要的理論依據(jù)。 參 考 文 獻 1 戴瑞鴻,李勇,范維琥，等. 保護內(nèi)皮細(xì)胞功能在防治心血管疾病中的重要性. 國際心血管雜志,2000 ,2 (4) : 328 2 謝志泉. 細(xì)胞凋亡與缺血性心臟病. 心血管病學(xué)進展,1999 ,20(5) :279 3 Olivetti G,Abbi R ,Quaini F， et alApoptosis in the failing humanheart.N Eng J Med ,1997,336:1131 4 Kehl F,Pagel PS,Krolikowski JG,et al.Is Isofluraneinduced Preconditioning Dose Related. Anesthesiology,2002,96(3):675680 5 Li F,Hayes JK,Wong KC, et al. Administration of sevoflurance prior to prolonged global ischemia improves heart function in isolated