沙鼠腦缺血再灌注后海馬中c-fos蛋白表達(dá)及納洛酮影響

1、    沙鼠腦缺血再灌注后海馬中c-fos蛋白表達(dá)及納洛酮影響        摘要目的觀察沙鼠腦缺血再灌注后納洛酮對(duì)海馬神經(jīng)元c-fos蛋白表達(dá)及神經(jīng)元形態(tài)改變的影響。方法采用沙鼠急性全腦缺血模型，用免疫組織化學(xué)及組織化學(xué)方法觀察海馬c-fos蛋白表達(dá)及細(xì)胞形態(tài)改變。結(jié)果納洛酮能明顯加強(qiáng)急性全腦缺血沙鼠海馬各區(qū)c-fos蛋白的表達(dá)，CA1區(qū)尤為明顯。同時(shí)納洛酮能明顯改善缺血后CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的變性壞死。結(jié)論納洛酮對(duì)缺血后海馬神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用可能與加強(qiáng)c-fos蛋白的表達(dá)

2、有關(guān)。關(guān)鍵詞腦缺血海馬納洛酮c-fos蛋白中號(hào)R743.3 Effect of Naloxone on c-fos Protein Expression in Rat Brain after Cerebral Ischaemia and ReperfusionLiu YonghaiGao Dianshuai(Department of Neurology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical college, Xuzhou 221002)ObjectiveThe aim of present study is to investegate the

3、 effect of naloxone on the c-fos protein expression in hippocampus neuron after transient global cerebral ischaemia. MethodsThe immunohistochemical and histochemical methods were used to evaluate the changes of the c-fos protein expression and cell structure in hippocampus. ResultsNaloxone had marke

4、d effect on the induction of c-fos protein expression and protected cell structure in hippocampus following transient global cerebral ischaemia in gerbils. ConclusionThe protective effect of naloxone on hippocampal neurons might be related with increasing c-fos protein expression after cerebral isch

5、aemia and re-perfusion.Key wordscerebral ischaemia; hippocampus; naloxone; c-fos protein原癌基因是生命科學(xué)的一項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)，當(dāng)今對(duì)原癌基因的研究已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出腫瘤學(xué)這一領(lǐng)域。近幾年的研究表明，全腦缺血可誘導(dǎo)一種立即早期基因(c-fos原癌基因)在海馬結(jié)構(gòu)短暫而快速的表達(dá)1，2。c-fos蛋白的表達(dá)主要發(fā)生于缺血后28h的海馬齒狀回、CA3和CA4區(qū)3。研究表明，納洛酮治療缺血性腦血管病可能獲得一定療效4。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法研究納洛酮對(duì)缺血沙鼠海馬各區(qū)中c-fos蛋白表達(dá)的影響，同時(shí)觀察對(duì)應(yīng)各區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)

6、的改變。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及急性全腦缺血模型制備沙鼠(雌雄隨機(jī))，體重4560 g(由徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，乙醚吸入麻醉，由腹側(cè)切開頸部皮膚，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，準(zhǔn)備好動(dòng)脈夾備用。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組1.2.1缺血組：4只。該組動(dòng)物雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉10min后恢復(fù)血流，存活5h后處死。1.2.2假手術(shù)對(duì)照組：4只。手術(shù)同前，雙側(cè)頸總動(dòng)脈不夾閉，同樣存活5h后處死。1.2.3缺血加納洛酮組：4只。該組動(dòng)物在頸總動(dòng)脈夾閉前10min腹腔注射納洛酮(按體重1mg/kg)，缺血10min后恢復(fù)血流，存活5h后處死。1.2.4缺血加生理鹽水組：4只。該組動(dòng)物在雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉前10min腹腔

7、注射生理鹽水0.4mL，缺血10min后恢復(fù)血流，存活5h處死。1.3免疫組化染色(ABC法)動(dòng)物存活5h后用苯巴比妥鈉(按體重4550mg/kg，ip)麻醉，先用40mL生理鹽水灌注，然后用100mL 40g/L多聚甲醛磷酸緩沖液(PB，pH7.4)灌注固定，取腦置于4后固定24h，冰凍切片，30m厚。腦片置于0.1mol/L磷酸緩沖液中(PBS，pH7.4)，洗3次，5min/次，再轉(zhuǎn)入含10%(體積分?jǐn)?shù))正常羊血清(NGS)和0.3%(體積分?jǐn)?shù))雙氧水的0.1mol/L PBS中室溫下孵育30min，然后放入含0.8%(體積分?jǐn)?shù)) Triton X-100和1%(體積分?jǐn)?shù)) NGS的PB

8、S液配制的-抗(抗c-fos蛋白，由Vector公司提供，1/2000稀釋)中，37下孵育6h，室溫下再放置24h，經(jīng)一抗孵育后的腦片用0.1mol/L PBS清洗3次，再依次加ABC藥盒中各試劑，具體步驟同Uemura等報(bào)道3。1.4組織學(xué)觀察另取3組動(dòng)物作一般形態(tài)染色觀察，依前述方法分假手術(shù)組(n=4)、缺血組(n=4)和缺血加納洛酮組(n=4)。各組動(dòng)物存活72h后處死，取腦置于40 g/L多聚甲醛、0.1mol/L PBS液中固定24h，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察神經(jīng)元形態(tài)改變。2結(jié)果2.1海馬各區(qū)c-fos表達(dá)假手術(shù)對(duì)照組海馬中未觀察到明顯的c-fos蛋白表達(dá)；缺血組海馬齒狀

9、回、CA3和CA4區(qū)都有較明顯的c-fos蛋白表達(dá)，而CA1區(qū)只有少數(shù)神經(jīng)元有c-fos蛋白表達(dá)；缺血加生理鹽水組海馬中c-fos蛋白表達(dá)與缺血組相比無差異；與缺血組相比，缺血加納洛酮組海馬各區(qū)c-fos蛋白表達(dá)都顯著加強(qiáng)，尤其CA1區(qū)加強(qiáng)更明顯。海馬各區(qū)c-fos蛋白表達(dá)結(jié)果見附表。附表沙鼠海馬各區(qū)c-fos蛋白表達(dá)結(jié)果TableThe result of c-fos protein expression in hippocampus neuronIschaemia(n=4)Ischaemia+Naloxone(n=4)Dentate gyrus+CA1 region±+CA2 r

10、egion+CA3 region+CA4 region+± Lower c-fos protein expression; +Mild c-fos protein expression；+ Marked c-fos protein expression; +Very marked c-fos protein expressiion 2.2組織形態(tài)觀察HE染色光鏡下觀察結(jié)果表明，假手術(shù)組海馬各區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。缺血組及缺血加生理鹽水組其海馬CA1區(qū)大多數(shù)神經(jīng)元出現(xiàn)變性壞死，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)形成空泡，核呈不規(guī)則固縮，深染等；而CA3及CA4區(qū)僅有少數(shù)神經(jīng)元變性壞死。缺血加納洛酮

11、組海馬CA3及CA4區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，CA1區(qū)只有個(gè)別神經(jīng)元有變性壞死表現(xiàn)。3討論研究證明，在急性腦梗死時(shí)，缺血區(qū)內(nèi)啡肽含量明顯增加，可進(jìn)一步損害缺血的腦組織。納洛酮為競(jìng)爭(zhēng)性阿片受體拮抗劑，自Baskin等首次報(bào)告納洛酮治療腦卒中有效以來，已進(jìn)行了大量的動(dòng)物和臨床研究4。納洛酮可減輕、阻止甚至逆轉(zhuǎn)由內(nèi)啡肽所造成的局部腦缺血、水腫、梗死性病理過程，防止缺血性損害擴(kuò)展5。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，沙鼠急性全腦缺血后，海馬c-fos蛋白表達(dá)主要局限于對(duì)缺血損傷有較強(qiáng)耐受性的齒狀回、CA3及CA4區(qū)，而在對(duì)缺血極為敏感的CA1區(qū)很少表達(dá)。目前認(rèn)為c-fos基因作為細(xì)胞核的“第三信使”，通過啟動(dòng)和調(diào)控某些

12、具有特殊功能意義的靶基因的表達(dá)，對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、分化、再生和重塑起著重要作用6。Lindvall等人7的研究表明，腦缺血后齒狀回c-fos基因表達(dá)增高，隨后伴有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子mRNA和神經(jīng)生長(zhǎng)因子mRNA明顯升高，因此，神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因已被確認(rèn)為是c-fos激活的靶基因。Kiessling等8發(fā)現(xiàn)，全腦短暫性缺血可誘導(dǎo)沙鼠海馬注定死亡神經(jīng)元只表達(dá)立即早期基因mRNA而不是蛋白，而存活神經(jīng)元立即早期基因mRNA和蛋白均表達(dá)，提示立即早期基因蛋白表達(dá)可能預(yù)示缺血細(xì)胞存活。本研究表明，納洛酮能明顯加強(qiáng)對(duì)缺血敏感的CA1區(qū)神經(jīng)元中c-fos蛋白表達(dá)，同時(shí)也能減輕該區(qū)神經(jīng)元的缺血性損傷。結(jié)果提示，c-fo

13、s蛋白可能參與缺血后機(jī)體對(duì)神經(jīng)元損傷的應(yīng)急保護(hù)機(jī)制，納洛酮具有保護(hù)腦缺血后海馬神經(jīng)元的作用，該作用可能與加強(qiáng)c-fos蛋白表達(dá)有關(guān)。作者單位：劉永海徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)科，徐州 221002高殿帥徐州醫(yī)學(xué)院解剖教研室參考文獻(xiàn)1Nowark JT, Ikeda J, Nakajima T. 70-kDa heat shock protein and c-fos gene expression after transient ischaemia. Stroke, 1990, 111(supple):107-1112Osamu T, Hidekazu T, Takehiko Y. Inductio

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