沙棗花黃酮成分的含量測(cè)定及其藥理作用的初步研究

1、沙棗花黃酮成分的含量測(cè)定及其藥理作用的初步研究<                 作者：王基云，姚遙，肖旭，王銳，陳虎，張振華，王妍【摘要】   目的參照 中國 藥典(2005版)測(cè)定沙棗花(Elaeagnus angustifolia blossoms，EAB )中總黃酮和蘆丁的含量，并初步探討沙棗花醇提物(the alcohol extract of Elaeagnus angustifolia blossoms，A

2、E-EAB ) 對(duì)四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。方法 參考 中國藥典通過分光光度法和高效液相色譜法測(cè)定EAB中總黃酮和蘆丁的含量，并通過測(cè)定小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性和肝 組織 勻漿中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)的活性及觀察肝臟形態(tài)學(xué)改變，研究不同劑量AE-EAB對(duì)小鼠CCl4急性肝損傷模型的保護(hù)作用。 結(jié)果測(cè)得EAB中總黃酮的含量為27 mg/g，蘆丁的含量為0.029 mg/g。與CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型比較, AE-EAB給藥組小鼠血清中ALT,AST活性明顯降低(P<0.05),同時(shí)小鼠

3、肝組織中MDA含量明顯下降(P<0.01),GSH含量有所升高(P<0.05), SOD活力明顯增強(qiáng)(P<0.01)。形態(tài)學(xué)觀察, AE-EAB能明顯減輕CCl4對(duì)肝組織的損傷。結(jié)論EAB 含有黃酮類化合物，AE-EAB對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】   沙棗花; 黃酮; 急性肝損傷; 四氯化碳Abstract：ObjectiveTo determine the contents of total flavonoids and rutin in Elaeagnus angustifolia blossoms(EAB)according to

4、 Technical Standard For Chinese Pharmacopo Ei a(2005 version) ,and to study the protective effects of the alcohol extract of Elaeagnus angustifolia blossoms(AE-EAB) on acute hepatic injury induced by carbon tetrachloride (CCl4) in mice.MethodsSpectrophotometric method and high performance liquid chr

5、omatography were used to determine the contents of total flavonoids and rutin in EAB，according to Technical Standard For Chinese Pharmacopo EI a(2005 version). The levels of ALT,AST in serum and MDA , SOD and GSH in liver were measured and the hepatic histological changes were observed by optical mi

6、croscope in order to study the protective effects of different doses of alcohol extract of AE-EAB on acute hepatic injury induced by 0.1% CCl4 in mice.ResultsThe content of total flavonoids of EAB is 27mg/g ( 27mg total flavonoids in 1g EAB ) , and that of rutin was 0.029 mg/g(0.029 mg rutin in 1g E

7、AB). Compared with model group, the levels of ALT, AST in serum were obviously decreased (P<0.05), and the level of MDA in liver was also lowered (P<0.05), but the activities of GSH and SOD in liver were markedly improved (P<0.05，P<0.01) after pretreatment with AE-EAB.AE-EAB ameliorated

8、the hepatic pathological changes too. ConclusionThe results show that EAB contains flavonoids, and AE-EAB has protective effects on acute hepatic injury induced by CCl4 in mice.Key words：EAB; Flavonoids ; Acute hepatic injury; Carbon tetrachloride沙棗花為胡頹子科植物沙棗Elaeagnus an gustifolia L .的花,主產(chǎn)于西北地區(qū)。寧夏沙

9、棗樹抗旱耐堿 ,具有很強(qiáng)的生命力 ,也是寧夏防風(fēng)固沙的重要植物。沙棗花呈銀白色，下垂，花呈漏斗形，長(zhǎng)57mm。據(jù)中藥大辭典記載 ,沙棗花主要含山萘酚、花白素、脂肪油和少量揮發(fā)油 ,具有止咳平喘的功能 ,可用于 治療 慢性氣管炎1。目前對(duì)沙棗花研究較多的是其揮發(fā)油成分2。本研究通過分光光度法測(cè)定了沙棗花醇提物中總黃酮的含量, 結(jié)果測(cè)得沙棗花中總黃酮的含量為27mg/g(即1g沙棗花乙醇提取物中含總黃酮27 mg);通過高效液相色譜法高效液相測(cè)定沙棗花乙醇提取物中蘆丁的含量，結(jié)果測(cè)得沙棗花乙醇提取物中蘆丁的含量為0.029 mg/g(即1g沙棗花乙醇提取物中含蘆丁0.029 mg)，表明沙棗花中含

10、有黃酮類物質(zhì)。本文還對(duì)沙棗花醇提取物浸膏對(duì)CCl4所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用做了初步研究,為進(jìn)一步開發(fā) 應(yīng)用 沙棗花提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1 材料與儀器 1.1 動(dòng)物清潔級(jí)健康昆明種小鼠,雄性,體質(zhì)量(20±2)g ，由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物合格證號(hào): SCXK(寧)2005-0001。1.2 試劑丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所);甲醇為色譜純(天津市江天化工技術(shù)有限公司),水為超純水,其它試劑均為分析純。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供) 。1.3

11、藥材沙棗花采自寧夏 醫(yī)學(xué) 院旁沙棗林，經(jīng)寧夏區(qū)藥品檢驗(yàn)所中藥研究室主任韓文欣鑒定為胡頹子科植物沙棗樹Elaeagnus angustifolia L.的新鮮花序。1.4 儀器高效液相色譜儀(日立 MODELL-2100/2130);AllSPhere ODS C18(4. 6mm×250 mm)色譜柱;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮); SHB-III型循環(huán)式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);KQ-3200 DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Mili-Q超純水儀(法國); 電子 天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);721分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司);高速低溫離心機(jī)(日立

12、公司 CF16RX);恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。 2 方法與結(jié)果 2.1 分光光度法測(cè)定沙棗花總黃酮的含量32.1.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取在120干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品50 mg,置于25 ml量瓶中,加甲醇適量,置水浴上微熱使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取10 ml,置100 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得(每毫升中含無水蘆丁0.2 mg)。2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液1，2.3，3，4，5，6 ml置25 ml量瓶中,各加亞硝酸鈉溶液1. 00 ml,混勻,放置顯色6 min,加10%硝酸鋁溶液1 ml,搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液1

13、0 ml,再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程Y=10.31X-0.003 5,相關(guān)系數(shù)r=0. 998 5,線性關(guān)系良好。2.1.3 測(cè)定法取本品粗粉1g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚適量，加熱回流至提取液無色，放冷，棄去乙醚液。再加甲醇90 ml，加熱回流至提取液無色，轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，用甲醇少量洗滌容器，洗液并入同一量瓶，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取10ml,至100 ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取3 ml，置25 ml量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲

14、線制備項(xiàng)下的方法，自“加亞硝酸鈉”起依法測(cè)定吸光度，測(cè)得吸光度值為0.030，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上算得供試品溶液中總黃酮的濃度為0.003 24 mg/ml，即算得沙棗花中總黃酮的含量為27 mg/g(即每克沙棗花中含有總黃酮27 mg)。2.2 RP-HPLC色譜法測(cè)定蘆丁的含量32.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取蘆丁對(duì)照品溶液(0.1 mg/ml)分別進(jìn)樣,進(jìn)樣體積分別為1，2，4，6，8，10，35，40 l,測(cè)定峰面積,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積A為縱坐標(biāo),得回歸方程為A=6.9×109C+191 498,相關(guān)系數(shù)為r=0. 999 8,蘆丁在0. 386.08 g范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。

15、見圖1。2.2.2 色譜條件色譜柱為ODS C18(4. 6 mm×250 mm),檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm,柱溫為室溫(30),流速1. 0 ml/min,流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸(3562.42.6 )。2.2.3 供試品溶液制備及蘆丁的含量測(cè)定 取沙棗花粗粉1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率25 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過。精密量取濾液5 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。用0. 45 m微孔濾膜過濾,進(jìn)樣10 l按“2. 1.1”項(xiàng)下色譜條件注入色譜儀,測(cè)峰面積。結(jié)果測(cè)得沙棗花乙醇提取物中蘆丁的含量為0.029 mg/g(即每克沙棗花乙醇提取物中含蘆丁0.029 mg)。見圖2。2.2.4 沙棗花醇提物浸膏的制備1.0 kg沙棗花切碎后,加3倍量80%乙醇加熱回流提取(1 h×