油茶總皂苷的抗氧化及清除自由基能力初步研究

1、油茶總皂苷的抗氧化及清除自由基能力初步研究呂曉玲，邱松山，孫曉俠，李肇獎（天津科技大學(xué)，天津）摘要：本文對所提取的油茶總皂苷進(jìn)行定性分析并測定其含量，研究了對由亞鐵離子引發(fā)的卵磷脂脂質(zhì)過氧化的抑制作用、清除反應(yīng)生成的羥自由基的能力、清除超氧陰離子自由基的能力、對脫氧核糖氧化損傷的抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示油茶總皂苷具有顯著的抗氧化性和對脫氧核糖氧化損傷的抑制作用，對化學(xué)反應(yīng)生成的的活性氧自由基具有顯著的清除作用。關(guān)鍵詞：油茶總皂苷；脂質(zhì)過氧化；活性氧自由基；抗氧化作用，（，）：（）（，：；中圖分類號：文獻(xiàn)標(biāo)識碼：文章編號：（）近年來，大量研究報道表明，體內(nèi)自由基導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化與抗氧化的平衡與一些

2、疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，如機(jī)體衰老、腫瘤、心腦血管病等。超）、羥自由基（，）等是生物體內(nèi)主要的活性氧自由基，由它們所引發(fā)的體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，是人類疾病發(fā)生和衰老的重要原因，因而，抑制脂質(zhì)過氧化物或增強(qiáng)抗氧化功能對防御疾病有重大意義。油茶皂苷（）屬于三萜類皂苷，簡稱皂苷（），是一類比較復(fù)雜的化合物，廣泛存在于植物界。油茶籽餅中所含為三萜皂苷，是皂苷元結(jié)構(gòu)糖相連接的多糖苷，其結(jié)構(gòu)如圖。油茶皂苷分子中具有親水性的糖體和疏水性的配位基團(tuán)，是優(yōu)良的天然非離子型表面活性劑，并具有多種生理活性和生理功能，可用作殺菌劑、殺蟲劑、利收稿日期：作者簡介：呂曉玲（），女，教授，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物研究與開發(fā)。尿劑等

3、，。目前國內(nèi)外對油茶皂苷的分離提取研究的較多，生理活性方面的研究主要集中在抑菌、消炎、殺精子等方面，其抗氧化能力等生理功能方面的作用機(jī)理的研究報道還不具有系統(tǒng)性，不利于油茶皂苷的更進(jìn)一步的開發(fā)與應(yīng)用。本文研究了油茶總皂苷對由亞鐵離子引發(fā)的卵磷脂脂質(zhì)過氧化的抑制作用、清除反應(yīng)生成的羥自由基的能力、清除超氧陰離子自由基的能力、對脫氧核糖氧化損傷抑制作用，并對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。材料與方法實(shí)驗(yàn)材料油茶籽餅購自福建三明；油茶皂苷標(biāo)準(zhǔn)品購自湖南漢生生物科技公司，經(jīng)薄層制備分離而得。硫代巴比妥酸（簡稱）上海恒信化工廠；脫氧核糖（，）分；抗壞血酸天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；三羥甲基氨基甲烷（簡稱）天津市瑞金

4、特化學(xué)品有限公司；苯甲酸，沒食子酸，硫脲，三氯化鐵，六氰合鐵酸鉀，三氯醋酸（簡稱），：均為國產(chǎn)分析純；卵磷脂（，）華東師范大學(xué)化工廠，其余均為實(shí)驗(yàn)室常用分析純試劑。大孔吸附樹脂、陽離子交換樹脂購自天津南開大學(xué)化工廠。實(shí)驗(yàn)儀器索氏提取器天津市玻璃儀器廠；離心機(jī)德國公司；旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器天津市玻璃儀器廠；紫外可見分光光度計北京瑞利分析儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋上海醫(yī)療器械五廠；分析天平上海精科天平公司；熒光分光光度計日本島津制作所等。實(shí)驗(yàn)方法油茶總皂苷的制備油茶籽餅干燥，控制水分，研碎，過目篩。加倍量石油醚，索氏抽提至抽提液無色，除去油脂，按料液比：（）加入，乙醇做提取劑，在水浴中浸提，三次，合并

5、浸提液并濃縮至原體積的三分之一，加入的硫酸鋁，攪拌，過濾，濾液過陽離子交換樹脂、大孔吸附樹脂，濾液減壓濃縮得油茶總皂苷。反應(yīng)取油茶總皂苷少許溶于乙酸酐中，加入濃硫酸一滴，觀察顏色變化。油茶總皂苷的含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備參考文獻(xiàn)中的方法，精密吸取油茶皂苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液各、，按文獻(xiàn)所述的方法進(jìn)行測定，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：相關(guān)系數(shù)：式中：吸光度；濃度，。油茶總皂苷的含量測定精密稱取油茶皂苷，配制成水溶液，測定方法同。抑制脂質(zhì)體過氧化作用的測定試液的配制脂質(zhì)體分散系（）：卵磷脂溶解于，冰浴震蕩。三氯醋酸（）硫代巴比妥酸（）鹽酸（）混合液：，濃鹽酸依序放入重蒸水中。測定步驟于樣品管中依次加入卵磷脂溶液（）、三

6、氯化鐵溶液、抗壞血酸和樣品，混勻，避光，于水浴中培養(yǎng)，再加入混合液，水浴中反應(yīng)，冰水中冷卻，以轉(zhuǎn)速離心，取上清液在測吸光值?？瞻坠芤灾卣羲鏄悠?，操作方法同樣品管，可測得空白管的吸光度（以硫脲作為標(biāo)樣，操作同上）。清除羥自由基能力的測定，取含苯甲酸的磷酸緩沖液（，），依次加入和混合液、不同濃度的油茶總皂苷以及溶液，并用磷酸緩沖液稀釋至，混勻，置水浴中保溫后，以熒光分光光度計（；入射、出射狹縫均為）測其吸光強(qiáng)度，計算羥自由基清除率。（以抗壞血酸作為標(biāo)樣，操作同上）清除率（）：不含有待測物的反應(yīng)液的吸光度值：含有待測物的反應(yīng)液的吸光度值油茶總皂苷的清除超氧陰離子自由基的能力測定，采用鄰苯三酚自氧

7、化法。取緩沖液（），依次加入乙二胺四乙酸鈉（）溶液，樣品溶液，水，混勻，于水浴中反應(yīng)，再加入鄰苯三酚，加入時計時，混勻，準(zhǔn)確反應(yīng)后，加入溶液，終止反應(yīng)，在處測定吸光度值?？瞻坠芤哉麴s水代替樣品，操作方法同樣品管，可測得空白管的吸光度。清除率（）：含有待測物的反應(yīng)液于的吸光度值；：不含有待測物的反應(yīng)液于的吸光度值。對脫氧核糖氧化損傷的影響取不同濃度的油茶總皂苷溶液各，依次與三氯化鐵溶液、（）緩沖液、脫氧核糖與抗壞血酸混合均勻。將此試液于條件下水浴中培養(yǎng)，加入（，及，依序放入甲醇中），于水浴中反應(yīng)，冷卻后在處測其吸光度，記為?？瞻坠苡弥卣羲鏄悠?，操作方法同樣品管，可測得空白管的吸光度。抑制率（

8、）結(jié)果與分析油茶總皂苷的定性反應(yīng)的顏色反應(yīng)呈陽性，說明提取物中含有三萜類皂苷。油茶總皂苷的含量實(shí)驗(yàn)中采用建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法確定油茶總皂苷的含量。按照方法測定制備的油茶總皂苷含量為（質(zhì)量比）。油茶總皂苷抑制脂質(zhì)過氧化作用本文選擇了常用的由引發(fā)的卵磷脂磷酸緩沖液分散系，通過檢測卵磷脂的氧化產(chǎn)物過氧化物經(jīng)分解產(chǎn)生的二級產(chǎn)物丙二醛（）來衡量脂質(zhì)體的氧化程度。在酸性條件下發(fā)生如下反應(yīng)，生成的粉紅色物質(zhì)在的有特征吸收值。表油茶總皂苷和抗壞血酸抑制脂質(zhì)過氧化作用的比較Table 1 Compare of inhibiting lipid peroxide between camelliasaponins a

9、nd Vitamin C組別濃度（）抑制率（）空白油茶總皂苷抗壞血酸由表可知，在本實(shí)驗(yàn)所測定的濃度范圍內(nèi)，油茶總皂苷與抗壞血酸對由引發(fā)的卵磷脂分散系過氧化的抑制能力均隨其濃度的增大而增大，在其加入量較?。舛容^低）時，加入量與清除率表現(xiàn)出量效關(guān)系，當(dāng)濃度增大到一定值時，清除率幾乎不再隨濃度的增加而改變，此時體系中產(chǎn)生的自由基幾乎全部被清除。其可能的反應(yīng)機(jī)理為：促進(jìn)過氧化脂（）和脂分子（）的分解和氧分子的活化產(chǎn)生自由基，從而生成多種可以進(jìn)入脂質(zhì)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，促進(jìn)反應(yīng)發(fā)生和進(jìn)行的游離基，在的催化作用下，發(fā)生如下均裂反應(yīng)，生成自由基傳遞式反應(yīng)，形成新的自由基。油茶總皂苷清除羥自由基的能力為了定量測定

10、油茶皂苷對羥基自由基的清除能力，利用反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，在存在的情況下可生成：由于是反應(yīng)性很強(qiáng)的自由基，存在壽命極短，所以利用苯甲酸捕捉該反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基，可形成具有熒光的羥苯甲酸，其熒光強(qiáng)度（）可代表生成的相對量。當(dāng)把油茶總皂苷和抗壞血酸加入這一體系后，被不同程度地清除，測定其熒光強(qiáng)度即可算出其相應(yīng)的清除能力。表油茶總皂苷和抗壞血酸清除羥自由基的能力的比較Table 2 Compare of scavenging hydroxyl radicals betweencamellia saponins and Vitamin C組別濃度（）清除率（）空白油茶總皂苷抗壞血酸由表中數(shù)據(jù)可以看出油

11、茶總皂苷對這一體系產(chǎn)生的羥基自由基有明顯的清除作用，在的濃度時，清除率可達(dá)，其清除能力明顯大于，由此數(shù)據(jù)說明，油茶總皂苷具有較強(qiáng)的清除的作用。油茶總皂苷的清除超氧陰離子自由基的能力鄰苯三酚在弱堿性（磷酸鹽緩沖液）環(huán)境中自身氧化分解產(chǎn)生該體系常用于測定或類似活性物質(zhì)對的歧化活性。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，積累，導(dǎo)致反應(yīng)液的吸光度（波長）在反應(yīng)開始后之內(nèi)隨時間變化而線性增大。因此在該時間內(nèi)，于處測定含被測物反應(yīng)液的吸光度隨時間的變化率，并與抗壞血酸比較便可得出被測物清除。按方法，測得油茶總皂苷與抗壞血酸清除超氧陰離子自由基能力如表所示：表油茶總皂苷和抗壞血酸清除超氧陰離子自由基能力的比較Table 3 Co

12、mpare of scavenging superoxide anion betweencamellia saponins and Vitamin C組別濃度（）清除率（）空白油茶總皂苷抗壞血酸清除率（）由表可以看出抗壞血酸清除超氧陰離子自由基的能力雖然隨濃度的增大而增強(qiáng)，但低于油茶總皂苷，油茶總皂苷的清除能力明顯強(qiáng)于抗壞血酸，說明油茶總皂苷具有較強(qiáng)的抗氧化性。對脫氧核糖氧化損傷的抑制作用氧自由基不但可以引發(fā)脂質(zhì)體的過氧化，還可以通過攻擊核酸，一方面可直接攻擊堿基使其互相結(jié)合，或生成過氧化物，造成堿基破壞；另一方面還可以從戊糖部分提取氫（），會造成主鏈斷裂。本文采用的實(shí)驗(yàn)體系是利用反應(yīng)發(fā)生羥自

13、由基，攻擊脫氧核糖，評估樣品保護(hù)脫氧核糖免于發(fā)生氧化損傷的作用。表油茶總皂苷和硫脲對脫氧核糖氧化損傷抑制作用的比較Table 4 Compare of inhibiting deoxyribose oxidative injurybetween camellia saponins and thiourea組別濃度（）抑制率（）空白油茶總皂苷硫脲由表可知，在本實(shí)驗(yàn)所測定的濃度范圍內(nèi)，油茶總皂苷與硫脲的對脫氧核糖氧化損傷的抑制作用均隨其濃度的增大而增大，油茶總皂苷的抑制作用在同樣條件下強(qiáng)于硫脲。但在本實(shí)驗(yàn)體系中，自由基的引發(fā)劑為，所以如果樣品具有亞鐵離子螯合能力，可以通過螯合抑制反應(yīng)的發(fā)生來保護(hù)脫

14、氧核糖，而非直接與自由基反應(yīng)，通過還原自由基來抑制其對脫氧核糖的破壞，這將在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。結(jié)論據(jù)報道，機(jī)體內(nèi)的活性氧及脂質(zhì)過氧化物（），可使氧化損傷，從而引發(fā)突變和癌癥，還可通過修飾等途徑加速動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。因此，及時清除機(jī)體內(nèi)活性氧和降低，即可延緩衰老，預(yù)防多種疾病。本實(shí)驗(yàn)中油茶總皂苷對由亞鐵離子引發(fā)的卵磷脂脂質(zhì)過氧化具有較好的抑制作用，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可以看出，油茶總皂苷具有顯著的清除羥自由基（）的能力、清除超氧陰離子自由基（）的能力及對脫氧核糖氧化損傷有顯著的抑制作用。油茶總皂苷的清除羥自由基（）和超氧陰離子自由基（）的能力較強(qiáng)，說明油茶總皂苷具有比較強(qiáng)的抗氧化性，能夠較

15、好的清除活性氧自由基，但是，本文只研究了其體外抗氧化的部分實(shí)驗(yàn)，下一步將進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)以探討其在生物體內(nèi)的清除自由基能力，總之，利用油茶皂苷的生物抗氧化性進(jìn)行進(jìn)一步的研究開發(fā)，具有很好的前景。參考文獻(xiàn)：李忠中藥抗氧化劑藥學(xué)通報，（）：柳榮祥幾種山茶屬植物中化學(xué)及活性研究綜述茶葉，（）：，（），：劉家駿茶皂甙抗真菌作用初步觀察安徽醫(yī)學(xué)，（）：王知登，熊永革油茶總皂甙對血清膽固醇濃度的影響貴州醫(yī)藥，（）：蘆金清，李一敏油茶籽殺精子活性的研究湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，（）：李肇獎，呂曉玲，姚秀玲，等油茶總皂苷提取工藝優(yōu)化中國食品添加劑，（）：陸蘊(yùn)如中藥化學(xué)北京：學(xué)苑出版社，（）：晏文潔，李家璞，杜平類黃酮抗氧

16、化力與其結(jié)構(gòu)之關(guān)系臺灣農(nóng)業(yè)化學(xué)與食品科學(xué)，（）：張爾賢，余麗君，周意淋，等誘發(fā)脂蛋白過氧化體系及對若干天然產(chǎn)物抗氧化作用的評價生物化生姜超臨界萃取物的抗氧化性研究張克梅，唐世洪，余佶，歐陽輝，吳竹青，袁德保（吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南吉首；吉首大學(xué)物電學(xué)院，湖南吉首）摘要：人們食用生姜有悠久的歷史。生姜作為一種常用的辛香料，具有很好的抗氧化作用，它對于保障人們的健康、抗老防衰、防止食品腐敗具有十分重要的意義。將不同方法提取得到的生姜提取物，以不同的濃度進(jìn)行抗氧化性實(shí)驗(yàn)。采用滴定法及法測定了生姜提取物的抗氧化性。通過實(shí)驗(yàn)證明，生姜超臨界萃取物比生姜乙醇提取物對自由基清除活性要強(qiáng)。生姜超臨界萃取物在最佳濃度為（提取物與豬油的質(zhì)量比）時對豬油的抗氧化性能最強(qiáng)。與乙醇浸提物相比，添加濃度相同時，生姜超臨界萃取物比生姜乙醇提取物最佳濃度為（提取物與豬油的質(zhì)量比）時對豬油的抗氧化性更強(qiáng)。檸檬酸、酒石酸、抗壞血酸對生姜的超臨界萃取物有比較明顯的協(xié)同效應(yīng)，其中與抗壞血酸的協(xié)同作用最強(qiáng)。關(guān)鍵詞：生姜；超臨界萃取；油脂；抗氧化作用；協(xié)同作用，（，；，）：，（），（），收稿日期：作者簡介：張克梅（），女，副教授，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物與開發(fā)。