田基黃對(duì)小鼠急性肝損傷的防治作用

1、田基黃對(duì)小鼠急性肝損傷的防治作用                    作者：林久茂，趙錦燕，周建衡，陳小峰，葉蕻芝，王瑞國  【摘要】  目的 探討田基黃對(duì)急性肝損傷防治作用的藥理機(jī)制。方法以四氯化碳（CCl4）制備小鼠急性肝損傷的模型，田基黃水煎劑灌胃，檢測(cè)小鼠血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)活力以及一氧化氮(NO)

2、、腫瘤壞死因子(TNF)-、白介素(IL)-6的含量，觀察肝組織的病理損傷程度。結(jié)果不同濃度的田基黃能不同程度地降低CCl4所致異常升高的小鼠血清中的ALT，AST，NO，TNF-，IL-6含量，升高SOD活性，并且改善肝臟組織的病理損傷。結(jié)論田基黃對(duì)CCl4所致小鼠肝損傷具有防治作用，其作用機(jī)制可能與降轉(zhuǎn)氨酶、提高抗氧化能力和抑制NO，TNF-，IL-6過量生成等有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  田基黃；四氯化碳；肝損傷；抗氧化；細(xì)胞因子Abstract:ObjectiveTo study the protective effect of Hypericum japonicum against

3、 acute liver injury in mice and its mechanism. MethodsAfter acate liver injury model was induced by carbon tetrachloride (CCl4) , mice were administrated intragastrically with  Hypericum japonicum.The serum ALT, AST, SOD, NO, TNF-, IL-6 were determined and pathological change of liver was obser

4、vedResultsHypericum japonicum could significantly decrease the elevation of serum ALT, AST, NO, TNF-, IL-6 induced by CCl4，and increase SOD activity，ameliorate the pathological injury of liverConclusionHypericum japonicum shows protective effect against experimental liver injury in miceDecrease the

5、serum ALT and AST, increaseing anti-peroxide, restraining produce of the serum NO, TNF- and IL-6,  may be one of its mechanismsKey words:Hypericum japonicum；  Carbon tetrachloride；  Haste liver injury；  Antioxidation；  Cell factor    田基黃原名地耳草，系藤黃科金絲桃屬植物地耳草Hype

6、ricum japonicum Thumb的干燥全草。味甘、微苦，性涼，歸肝、膽、大腸經(jīng)。具有清熱利濕、散淤止痛、消腫解毒的功效1。生于田野較濕潤處，廣布于長江流域及其以南各地，主產(chǎn)于江西、福建、廣東、廣西、四川、貴州等地。含有黃酮類、內(nèi)酯類、色原烯類、縮二氨酸衍生物、咕噸酮類、間環(huán)己三醇衍生物等化合物2。藥理研究表明，田基黃具有抑菌、抗病毒、保肝、抑制癌細(xì)胞、增強(qiáng)免疫、抗氧化、止血以及對(duì)心血管的雙向調(diào)節(jié)等多種藥功效3。為探討田基黃保肝降酶的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用了CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的動(dòng)物模型，對(duì)其進(jìn)行研究觀察。現(xiàn)將田基黃保護(hù)CCl4所致小鼠急性肝損傷的藥理作用機(jī)制的研究結(jié)果報(bào)道如下。1

7、  器材1.1  動(dòng)物清潔級(jí)昆明種健康小鼠60只，體重1822 g，雌雄各半，動(dòng)物由福建中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK（閩）2005-0003，正常喂養(yǎng)，置實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.2  藥材與試劑田基黃購自福建中醫(yī)學(xué)院國醫(yī)堂，并經(jīng)鑒定為藤黃科植物田基黃的全草；四氯化碳（CCl4），上海聯(lián)化化工試劑有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20051022，分析純；生理鹽水注射液，福州福藥制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)050103A07；AST，ALT，NO，SOD，MDA測(cè)試藥盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；TNF-、IL-6試劑盒，解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所產(chǎn)品。

8、1.3  儀器LXJ-2B低速大容量離心機(jī)、DDL-5低速冷凍離心機(jī)，上海安亭儀器廠產(chǎn)品；HH.W21>600電熱恒溫水浴箱，上海醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；AB204-N天平，梅特勒公司產(chǎn)品；BT224半自動(dòng)生化分析儀，意大利儀器；FJ-2008PS g放射免疫計(jì)數(shù)器，西安核儀器廠產(chǎn)品；BH-2系統(tǒng)顯微鏡，OLYMPUS公司產(chǎn)品。2  方法2.1  藥物及試劑配制田基黃用冷水浸泡，煎煮2次，過濾，合并濾液，濃縮成含生藥2 g /ml的水煎液，用前配成0.5，1.0，2.0 g/ml溶液，各以低、中、高劑量標(biāo)之；將聯(lián)苯雙酯（BPD）滴丸配制成20 mg/ml的溶液；0.

9、2% CCl4花生油溶液是用新鮮純花生油作為溶劑按體積比配制。其他測(cè)試試劑按相關(guān)的藥盒說明書進(jìn)行配制。2.2  動(dòng)物造模給藥取小鼠50只，稱重，按性別、體重隨機(jī)分為5組（即空白組、CCl4模型組、田基黃低劑量組、田基黃中劑量組、田基黃高劑量組），每組10只，雌雄各半?？瞻捉M和CCl4模型組予以生理鹽水灌胃，余各組予以田基黃低、中、高劑量提取物溶液灌胃，各組均按0.1 ml/10 g體重灌胃量給藥，1次/d。于第1，4天在給藥30 min后，空白組腹腔注射生理鹽水，余各組腹腔注射CCl4溶液，各組按0.1 ml/10 g體重注射，正常喂養(yǎng)，連續(xù)7 d。2.3  取材于末次給藥

10、24 h后取材，摘眼球法取血約1ml，4 3 000 r/min離心10 min分離血清，于-20保存待測(cè)；取血后處死小鼠，立刻剖開腹腔，暴露肝臟，剪取小塊右葉中央部位肝臟組織，約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，迅速投入10%福爾馬林溶液中固定，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下作組織病理學(xué)檢查。2.4  指標(biāo)檢測(cè)各指標(biāo)分別按相關(guān)的試劑盒操作說明書進(jìn)行；肝組織病理學(xué)檢查，在光鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學(xué)變化。肝組織病理學(xué)改變分為5級(jí)：正常肝細(xì)胞“-”;肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死“+”；肝細(xì)胞灶狀壞死“+”；肝小葉不足1/3肝細(xì)胞壞死“+”；肝小葉超過1/3肝細(xì)胞壞死“+”

11、。2.5  數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS12.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料，采用F檢驗(yàn)，結(jié)果用±s表示；計(jì)數(shù)資料，應(yīng)用Ridit檢驗(yàn)。1         3  結(jié)果3.1  田基黃對(duì)小鼠血清中ALT，AST活性的影響模型組小鼠血清中的ALT和AST含量明顯高于空白組(P<0.01)，表明模型制作成功；田基黃低、中、高不同劑量對(duì)CCl4所致轉(zhuǎn)氨酶（ALT和AST）的升高具有顯著的降低作用（與模型組比較，P<0.01）；而田基黃低劑量組降低ALT的作用尤為突出，但降A(chǔ)ST的作

12、用不同劑量間沒有顯著區(qū)別。結(jié)果見表1。表1 各組小鼠血清中ALT，AST活性的比較(略)3.2  田基黃對(duì)小鼠血清中SOD活性與NO含量的影響模型組小鼠血清中SOD含量明顯低于空白組（P<0.01），NO含量明顯高于空白組（P<0.01）。田基黃高、中劑量對(duì)CCl4所致的SOD活性降低具有顯著的升高作用（與模型組比較，P<0.01），而田基黃低劑量對(duì)CCl4所致的SOD活性降低無顯著性作用（與模型組比較，P>0.05）。田基黃低、中、高劑量對(duì)CCl4所致NO的升高具有顯著降低作用（與模型組比較，P<0.05）。結(jié)果見表2。表2  各組小鼠血清中

13、SOD活性與N0含量的比較(略)3.3  田基黃對(duì)小鼠血清中TNF-，IL-6含量的影響模型組小鼠血清中TNF-，IL-6含量明顯高于空白組，提示肝臟受損傷時(shí)可導(dǎo)致血清TNF-，IL-6含量增高。田基黃高劑量組對(duì)CCl4所致的TNF-的升高具有明顯降低作用（與模型組比較，P<0.05）；而中、低劑量也有一定的降低作用趨勢(shì)，但沒有顯著性意義（與模型組比較，P>0.05）。田基黃低、中、高不同劑量對(duì)CCl4所致IL-6的升高具有顯著的降低作用（與模型組比較，P<0.01）。結(jié)果見表3。表3  各組小鼠血清中TNF-，IL-6含量的比較(略)3.4 

14、田基黃對(duì)小鼠肝組織病損傷的影響組織病理學(xué)觀察結(jié)果表明，空白組小鼠肝組織未出現(xiàn)明顯病理變化。肝組織以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列且吻合成網(wǎng)，肝細(xì)胞之間的肝竇亦吻合成網(wǎng)，可見多個(gè)肝小葉及結(jié)締組織構(gòu)成的匯管區(qū)，肝細(xì)胞較大呈多邊形，胞質(zhì)嗜酸性。模型組小鼠肝細(xì)胞變性壞死嚴(yán)重，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞廣泛變性壞死，胞漿疏松化和氣球樣變；匯管區(qū)與中央靜脈區(qū)肝細(xì)胞壞死相連呈橋接壞死，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤。模型組小鼠肝損傷嚴(yán)重程度與空白組比較有非常顯著差異(P<0.01)，提示造模成功。各用藥組肝細(xì)胞變性壞死程度明顯減輕，與模型組比較有顯著差異；與模型組比較，田基黃低劑量組有顯著性差異(P<0.05

15、)，余組均有非常顯著性差異(P<0.01)。結(jié)果見表4。表4  田基黃對(duì)各組小鼠肝組織病理學(xué)損傷的影響（略）4  討論    本實(shí)驗(yàn)采用最常用的CCl4肝損傷的動(dòng)物模型，指標(biāo)明確，重復(fù)性好。CCl4進(jìn)入機(jī)體后，產(chǎn)生一系列的化學(xué)反應(yīng)，使肝細(xì)胞壞死，同時(shí)，肝臟由于CCl4攻擊而受到損傷，使得轉(zhuǎn)氨酶(ALT和AST)、炎癥介質(zhì)(NO，TNF-和IL-6等)異常增高、SOD活性降低。其中，ALT和 AST是診斷肝膽系統(tǒng)疾病中應(yīng)用最廣泛的酶，是判斷肝細(xì)胞受損害程度的敏感指標(biāo)；SOD可阻止CCl4進(jìn)入機(jī)體后生成三氯甲基自由基破壞肝細(xì)胞；在肝損傷中，各

16、種炎癥物質(zhì)可誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生并釋放各種細(xì)胞因子，TNF-，IL-6是重要的炎癥反應(yīng)介質(zhì)，占有非常重要的地位，而TNF-在體內(nèi)也能誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成IL-6，參與了肝炎的發(fā)病機(jī)制4,5。過量的NO本身可作為自由基或通過與自由基反應(yīng)生成毒性更強(qiáng)的自由基等造成肝損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞毒作用。已有大量的研究表明NO,TNF-和IL-6在多種原因引起的肝損傷中起重要作用，因此抑制NO，TNF-和IL-6的過量產(chǎn)生在肝損傷的防治過程中有重要的意義。    實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，田基黃能明顯抑制CCl4引起的小鼠血清ALT，AST活性的升高，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，加速自由基的清除，抑制NO，TNF-和IL-6的過量分泌，抑制NO的細(xì)胞毒作用，并對(duì)細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫性炎癥反應(yīng)性損傷具有保護(hù)作用，可保護(hù)和修復(fù)肝細(xì)胞病理學(xué)損傷，從而保護(hù)肝臟的結(jié)構(gòu)和功能。提示這些可能是田基黃對(duì)CCl4所致肝組織損傷具有防治作用的部分藥理作用機(jī)制。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)填補(bǔ)了田基黃在保肝、抗肝炎作用過程中，對(duì)一些細(xì)胞因子（NO，TNF-和IL-6）影響的相關(guān)性研究的空白，同時(shí)為臨床應(yīng)用提供相