細(xì)胞流式文章

1、白藜蘆醇對C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制生長和誘導(dǎo)凋亡的作用王廣秀 浦佩玉 康春生 王虎 董倫 李彥和 張志勇摘要 目的 研究白藜蘆醇（resveratrol，Res）在體外抑制C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡及其作用機(jī)制。方法 以不同濃度Res處理C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞24，48，72，96h，用MTT法檢測其對細(xì)胞生長增殖的抑制作用，用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測其對細(xì)胞周期及凋亡的影響，用蛋白印跡（Westernblot）檢測Res處理前后C6細(xì)胞EGFR、GFAP、Bcl-2及Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果 Res抑制C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖呈濃度和時間依賴性，細(xì)胞被阻滯于S期，明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Res可抑制

2、EGFR、Bcl-2蛋白表達(dá)，而上調(diào)GFAP、 Caspase-3 表達(dá)。結(jié)論 Res可以下調(diào)EGFR及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，有潛在的臨床應(yīng)用價值。主題詞 白藜蘆醇；C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞；增殖；凋亡；表皮生長因子受體Effects of resveratrol in inhibiting growth of rat C6 glioma and inducing its apoptosis WANG Guangxiu PU Peiyu KANG Chunsheng WANG Hu DONG Lun LI Yanhe ZHANG Zhiyong Department of ne

3、urosurgery，Tianjin Medical University General Hospital， Tianjin 300052，ChinaCorresponding author：PU Peiyu，E-mail：ppyuAbstract Objective To investigate the effect of resveratrol on proliferation and apoptosis of C6 rat glioma cells in vitro. Methods C6 rat glioma cells were treated with resveratrol a

4、t various concentrations. MTT assay was used to determine the inhibitory rate of cell growth at 24，48，72 and 96 hours and flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis status before and after the resveratrol treatment ，Western blot was used to examine the expression of EGFR，GFAP，Bcl-2 a

5、nd Caspase-3. Results Resveratrol inhibited the growth of C6 rat glioma cells in a dose-and time-depentent manner and induced cell apoptosis。Cell cycle was blocked in S phase。Western 作者單位: 300052 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科，天津市神經(jīng)病學(xué)研究所，神經(jīng)腫瘤實(shí)驗室blot showed that resveratrol downregulated the expression of EGFR and Bc

6、l-2 while upregulated the GFAP and Caspase-3 expression . Conclusion Resveratrol could inhibit glioma cell proliferation and induce the cell differentiation and apoptosis possibly through downregulation of EGFR signal pathway.Keywords Resveratrol；glioma；apoptosis；EGFR白藜蘆醇（Resveratrol）是一種廣泛存在于植物中的植物補(bǔ)

7、體，Res不但可以作為一種抗氧化劑，有防治心血管疾病的功效。而且具有抗炎和抗癌的作用1,2，它可以在腫瘤的起始、發(fā)生、進(jìn)展等各個階段通過多種途徑起到抑制腫瘤的作用，在前列腺癌、肝癌、白血病、食管癌等2,8,10,17中已有報道，而Res對膠質(zhì)瘤的抑瘤作用報道甚少，近年來有關(guān)膠質(zhì)瘤的大量的研究證實(shí)，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的基因擴(kuò)增和過表達(dá)是惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的重要始動事件之一，其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮著關(guān)鍵的作用5。本實(shí)驗進(jìn)一步就Res對C6鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長增殖的抑制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及其與膠質(zhì)瘤增殖、凋亡相關(guān)的EGFR等重

8、要基因變化進(jìn)行了探討。材料與方法1藥品與試劑 白藜蘆醇（resveratrol，Res）購自Sigma公司，用二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司產(chǎn)品）溶解，滅菌。實(shí)驗前以DMEM（Dulbecoo modifed eagle medium）培養(yǎng)液稀釋成不同濃度，DMSO終濃度小于0.3%。噻唑藍(lán)（MTT）購自Sigma公司，臨用前，用pH7.4的PBS配制成5g-1溶液。Annexin V 凋亡試劑盒：B.D公司產(chǎn)品。DMEM培養(yǎng)粉：Gibco公司產(chǎn)品。Western blot 所用抗體（EGFR，GFAP，CASPARE-3，BCL-2）為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。2細(xì)胞培養(yǎng) C6

9、鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞（美國NIH，江浩博士惠贈）培養(yǎng)在10%熱滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置370C，5%CO2培養(yǎng)箱,2-3 d 傳代1次。3 C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，實(shí)驗分5組，空白組：只加含10%小牛血清的DMEM；對照組：加含0.3%DMSO及10%小牛血清的DMEM;實(shí)驗組：同空白組外，分別加入濃度為50µm,100µm,150µm的Res,于處理后的24-96h期間,觀察細(xì)胞形態(tài)變化.4C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長抑制實(shí)驗 將處于對數(shù)生長期的C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，4000個/ 10

10、0µl /孔，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的Res（50，100，150µm）處理，對照組加100µl含與Res相應(yīng)濃度DMSO的培養(yǎng)液，空白組加100µl培養(yǎng)液，每組重復(fù)3孔，370C，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后的24，48，72，96h，每孔加入20µl 5gL的MTT，于培養(yǎng)箱中孵育4h，吸去上清，每孔加150µlDMSO，酶標(biāo)儀檢測各孔的光密度吸收值(A),取每組3孔均值,按照下列公式計算細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率=實(shí)驗組細(xì)胞的A值/對照組的A值×100%5流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化成單

11、細(xì)胞懸液種于直徑10cm的培養(yǎng)皿中,24小時內(nèi)細(xì)胞的融合率達(dá)到60-70%,對照組用0.3%的DMSO處理,實(shí)驗組用50µm 、100µm、150µm的Res處理48h后，濾網(wǎng)過濾后，無水乙醇40C固定過夜，RNase A消化，碘化丙啶(PI)染色30min，應(yīng)用FACScalibar（Becton Dickinson，USA）流式細(xì)胞儀檢測，氬離子激光器激發(fā)波長為488nm，以鱉血（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院外科研究所提供）細(xì)胞的G0/G1為內(nèi)對照，應(yīng)用Modifit軟件分析結(jié)果。6.細(xì)胞凋亡的檢測 細(xì)胞的處理同上，細(xì)胞經(jīng)不同濃度的Res處理48h后, 收集漂浮的及胰酶

12、消化的貼壁細(xì)胞,PBS洗滌2次，將細(xì)胞重懸與200l Binding buffer ,加入10l Annexin V -FITC和5l PI標(biāo)記，按試劑盒說明操作，避光室溫反應(yīng)15分鐘，F(xiàn)ACScalibar分析細(xì)胞凋亡。. 7. Western blot檢測EGFR、Bcl-2、Caspase-3及膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)： 將C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞分組，對照組用含0.3%DMSO的培養(yǎng)液處理,實(shí)驗組用含50µm 、100 µm、150µm Res的培養(yǎng)液 處理48h后,收集細(xì)胞裂解物,提取總蛋白，紫外分光光度法定量。用50µg蛋白進(jìn)行Wester

13、n印跡檢測，蛋白電泳后，MINI TRANS-BLOT電轉(zhuǎn)至PVDF膜（Milipore）后封閉，一抗（EGFR、 Bcl-2、Caspase-3、GFAP均為1：500稀釋）過夜，洗膜30min（1×PBS，0.1% Tween-20）、辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG抗體（1：500）2h。ECL（Enhanced chemiluminescent，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法）化學(xué)檢測系統(tǒng)（Pierce公司）檢測，X光膠片適度曝光。再行-actin二次結(jié)合：即用70水浴洗膜30min（62.5 mMTris-HCl pH6.8, 2% SDS, 100mM 巰基乙醇）后同法以鼠肌動蛋白單抗（-act

14、in，1:500）檢測作為內(nèi)對照。結(jié) 果一、細(xì)胞形態(tài)的觀察對照組與空白組C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長形態(tài)無明顯差異，而不同濃度的Res藥物處理后則隨著藥物濃度加大，細(xì)胞腫脹、體積變大，突起延長較明顯，胞核內(nèi)出現(xiàn)一些空泡，部分細(xì)胞胞漿內(nèi)可出現(xiàn)黑顆粒，有絲分裂減少，隨時間延長，死亡細(xì)胞逐漸增多，呈明顯的劑量和時間依賴性（見圖1）。二、Res對C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長抑制作用Res在50µm 150µm濃度范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，對鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，藥物濃度為50µm作用24h后細(xì)胞的存活率為98%，而當(dāng)藥物濃度增加到150µm作用24h細(xì)胞

15、的存活率為57%;藥物濃度為50µm作用96h后細(xì)胞的存活率為64%，而藥物濃度150µm作用96h細(xì)胞的存活率僅為21%，故其對細(xì)胞生長抑制作用呈濃度和時間依賴性（圖2），IC50為75µm100µm。三、FCM檢測Res處理后C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期時相分布C6細(xì)胞經(jīng)不同濃度的Res處理后，與對照組比較，隨藥物濃度增加，G0+G1及G2+M期細(xì)胞逐漸下降而S期細(xì)胞比例則明顯上升，說明Res處理后細(xì)胞被阻制滯于S期，見表1。四、Annexin V檢測Res處理后C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)Res處理48h后,隨著藥物濃度的增加,凋亡細(xì)胞的

16、數(shù)目也逐漸增加, 150µm的Res處理48h后,凋亡細(xì)胞的數(shù)目達(dá)到82%,比50µm濃度的凋亡數(shù)增加57%.（圖3）五、蛋白印跡檢測EGFR、GFAP、Bcl-2、Caspase-3 在鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的表達(dá)C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)50µm 、100µm、150µm Res處理24h后,用Western blot檢測表明Res可上調(diào)C6細(xì)胞GFAP的表達(dá), 而該膠質(zhì)瘤細(xì)胞過表達(dá)的EGFR明顯下調(diào)，同時Res還可降低參與凋亡的重要癌基因Bcl-2的表達(dá)、上調(diào)凋亡效應(yīng)因子caspase-3的活性,，其中均以150µm Res處理后變化最顯著（

17、圖4）。討論Res可通過細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)凋亡等多種途徑起到抗腫瘤的作用2，3，4，11，13,18。已發(fā)現(xiàn)其對乳腺癌、食管癌、肝癌、白血病、膀胱癌8，19，20等均有一定的抑瘤作用，被認(rèn)為是最有希望的天然的化學(xué)防癌劑之一。但有關(guān)對膠質(zhì)瘤的抑制生長作用及其機(jī)制研究較少。我們研究表明,C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)Res處理后，Res對膠質(zhì)瘤生長增殖抑制作用呈明顯的時間及劑量依賴性， 且細(xì)胞阻滯于S期。 C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞經(jīng)Res處理后，其GFAP的表達(dá)升高。GFAP是星形細(xì)胞分化的特異標(biāo)記物，分化不良或呈惡性表型的星形細(xì)胞表達(dá)下調(diào)或缺失，若將GFAPcDNA轉(zhuǎn)染C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系后,C6細(xì)胞生長受抑并呈現(xiàn)

18、成熟的分化狀態(tài),GFAP基因表達(dá)上調(diào)。此外，體外研究中也發(fā)現(xiàn)C6細(xì)胞經(jīng)EGFR下游重要效應(yīng)因子之一PI3K的抑制劑處理后，可以使GFAP集中分布在中心粒周圍,使細(xì)胞形態(tài)趨于成熟化15,16。而我們的研究表明，Res作用于C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，可使GFAP的表達(dá)升高，從而可使C6細(xì)胞惡性表型有所逆轉(zhuǎn)。Bcl-2是參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要癌基因之一，在腫瘤細(xì)胞中往往過表達(dá)6，以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。據(jù)報道Res作用于腫瘤細(xì)胞后，可下調(diào)Bcl-2表達(dá)及上調(diào)Bax表達(dá)，直接影響線粒體膜的滲透作用，然后激活Caspase-9，-3，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡7 。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，Res可以下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，而

19、且明顯上調(diào)凋亡效應(yīng)因子Caspase-3的表達(dá)，Caspase-3是半胱天冬酶家族中重要的細(xì)胞凋亡的執(zhí)行蛋白，高活性的Caspase-3可切割細(xì)胞骨架，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而起到抑制腫瘤作用。Park等將Res作用于U937人白血病細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，可使高表達(dá)的Bcl-2的水平降低，激活Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與我們的發(fā)現(xiàn)一致20。表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）是惡性膠質(zhì)瘤的重要責(zé)任基因之一。其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，EGFR的突變、擴(kuò)增與過表達(dá)是惡性膠質(zhì)瘤尤其是在原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤早期和主要的分子事件

20、。我們將不同藥物濃度的Res作用于C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)隨藥物濃度的增加，作用時間的延長，腫瘤細(xì)胞的存活率逐漸降低，蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)EGFR蛋白的表達(dá)也明顯降低，故我們推測Res很有可能通過下調(diào)EGFR及其信號通路起到抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的作用。Jubilee等將Res作用于與雄激素分泌無關(guān)的前列腺癌細(xì)胞PC-3的研究中發(fā)現(xiàn)Res可通過抑制依賴EGFR的Erk1/2的活性，從而選擇性地抑制PKC，影響增殖信號通路而起到抑制惡性前列腺癌細(xì)胞增殖的作用13。可見Res的抗腫瘤作用在某些腫瘤中也與EGFR存在著一定的關(guān)系。我們的研究表明，Res作用于C6鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，細(xì)胞周期檢測腫瘤

21、細(xì)胞大多被阻滯在S期，可上調(diào)GFAP的表達(dá)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性表型，下調(diào)重要的抑制凋亡分子Bcl-2及增強(qiáng)凋亡效應(yīng)分子Caspase-3活性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，下調(diào)EGFR信號通路抑制腫瘤細(xì)胞的增殖作用，故Res有可能成為輔助的臨床治療膠質(zhì)瘤的化療藥物，值得進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn):1 Jang M ，Cai J，Udeani GO， et al.Caner chemopreventive activity of resveratrol a natural product derived from grapes . Science,1997,275:218-2202 Clement MV, Hirpa

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