人類免疫缺陷病毒核酸擴增熒光定量檢測標準操作規(guī)程

1、人類免疫缺陷病毒核酸擴增熒光定量檢測標準操作規(guī)程    利用一對人類免疫缺陷病毒（HIV-1）的特異性引物、一個特異性熒光探針，采用逆轉錄酶、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，并應用RT-PCR技術實現(xiàn)對HIV-1 RNA gag基因區(qū)域的擴增。選取的靶區(qū)域是gag基因區(qū)域中部的一段保守區(qū)，長度102bp     利用一對人類免疫缺陷病毒（HIV-1）的特異性引物、一個特異性熒光探針，采用逆轉錄酶、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，并應用RT-PCR技

2、術實現(xiàn)對HIV-1 RNA gag基因區(qū)域的擴增。選取的靶區(qū)域是gag基因區(qū)域中部的一段保守區(qū)，長度102bp。gag基因位于HIV-1基因組的5端約7902292nt處，編碼核衣殼蛋白等結構蛋白。同時利用熒光探針(Taqman探針和雜交雙探針)檢測技術，該探針能與引物擴增區(qū)域中間的一段模板發(fā)生特異性結合，隨著PCR過程的進行，熒光信號發(fā)生相應的變化，使用在線監(jiān)測的熒光PCR檢測儀，即可同時實現(xiàn)對靶核苷酸序列的擴增及自動檢測。還對引物和探針進行了優(yōu)化，使得對HIV-1 B，B，C，E等中國主要流行亞型有相似的擴增效率。 用于人血漿樣本中的HIV-1 RNA的定量測定，適用于HIV感染的輔助診斷

3、，抗HIV-1藥物治療的效果的檢測。 抗病毒藥物的療效評價主要直接依賴兩個指標：血漿中HIV RNA滴度和CD4+細胞數(shù)。在抗病毒藥物治療的跟蹤中，本試劑盒可定量測定血漿中HIV RNA滴度，動態(tài)地反映治療中HIV RNA滴度的變化，為療效評價提供指標。 當前對HIVAIDS的診斷主要依靠實驗室檢測，即HIV抗體檢測。抗體檢測很大程度上降低了HIV經(jīng)血傳播的危險性，但由于窗口期的存在，仍然不能完全避免。P24抗原檢測可將“窗口期”縮短5-6天，但其在外周血中的存在時間非常短。而核酸檢測方法可將“窗口期”縮短10-15天，更進一步降低了HIV經(jīng)血傳播的危險性。HIV核酸檢測的對象還包括HIV陽性

4、母體所生的嬰兒、陽性患者的性伴侶、靜脈吸毒者和可疑的血清反應者。 1、 儲存條件 1.1 裂解液置4保存。 1.2 其他試劑均應目測為透明液體，20保存，不宜反復凍融。 1.3 使用前應在室溫下完全融化，并充分振蕩混勻后稍事離心。 1.4 所有試劑避光保存。 2、 有效期 所有試劑有效期為12個月（請于有效期內(nèi)使用）。 3、自備物品 自備試劑（分析純） 氯仿、異丙醇（20預冷）、75乙醇（用DNase、RNase Free水配制，20預冷） 4、自備儀器 4.1 PCR前準備區(qū)： 標準臺式高速離心機 移液器（1-20ul,20-200ul,100-1000ul） 一次性耗材（吸頭、離心管、手套

5、、帽子等） 專用工作服、工作鞋、辦公用品 4.2 樣本處理區(qū)： 高速冷凍離心機 移液器（1-20ul,20-200ul,100-1000ul） 一次性耗材（吸頭、離心管、手套、帽子等） 專用工作服、工作鞋、辦公用品 4.3 檢測區(qū)： 小型離心機 移液器（1-20ul,20-200ul） 熒光PCR檢測儀 一次性耗材（吸頭、離心管、手套、帽子等） 專用工作服、工作鞋、辦公用品 建議使用離心管和吸頭一覽表         名稱        

6、;規(guī)格        生產(chǎn)廠家        Cat.No.             吸頭        10ul        美國AXYGEN公司 

7、;       TF-300             200ul        TF-200             1000ul      

8、0; TF-1000             離心管        0.5ml        MCT-060-C             1.5ml   

9、60;    美國QSP公司        509-GRD-SC             2.0ml        508-GRD        5、樣本采集、存放及運輸 5.1 用無菌注射針頭采2m

10、l靜脈血于含有EDTA作為抗凝劑的無菌離心管中【不可用肝素抗凝】，室溫放置不應超過4小時，室溫1600g離心20分鐘，分離血漿【切勿吸入紅細胞】，轉入無菌離心管中備用。 5.2 待測樣本在2-8保存不應超過24小時；-20保存不超過三個月； -70以下長期保 存。應避免反復凍融。（最多凍融3次）。 5.3 采用冰壺或泡沫箱加冰密封進行運輸。 6、適用儀器 Roche LightCycler，Roter-Gene 2000/3000,PE Gene Amp 5700，PE Gene Amp 7700，ABI-7000，ABI-7300，BIO-RAD iCycler，Line-Gene，Line

11、-Gene，MJ Opticon，MJ Opticon 等國內(nèi)市場主流熒光PCR儀 7、擴增試劑準備（PCR前準備區(qū)） 7.1 從試劑盒中取出HIV RT-PCR反應液、RT-PCR酶、PCR Enhancer，在室溫下融化并振蕩混勻后，2,000rpm離心10sec。 7.2 設所需要的PCR反應管數(shù)為n(n=樣本數(shù)1管陰性對照1管強陽性對照1管臨界陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表： 7.21 Roche LightCycler ,Roter-Gene2000/3000儀器，準備相應數(shù)量的毛細管       

12、0; 試 劑        RT-PCR反應液        RT-PCR酶        PCR Enhancer             用 量       

13、0;955 ul        0.25 ul        0.2 ul     計算好各試劑的使用量，加入一適當體積離心管中，充分混合均勻，2000rpm離心10sec，向設定的n個Roche毛細管(LightCycler)中或普通PCR反應管(Roter-Gene2000/3000)中分別加入10ul，轉移至樣本處理區(qū)。 7.22 PE Gene Amp 5700，PE Gene Amp 7

14、700，ABI-7000，ABI-7300，BIO-RAD iCycler，Line-Gene，Line-Gene，MJ Opticon，MJ Opticon 等儀器，準備好相應的反應管         試 劑        RT-PCR反應液        RT-PCR酶       &

15、#160;PCR Enhancer             用 量        341 ul        0.5 ul        0.4 ul     計算好各試劑的使用量，加入一適當體積離心

16、管中，充分混合均勻，2000rpm離心10sec，向設定的n個PCR 反應管中分別加入35ul，轉移至樣本處理區(qū)。 8、樣本處理（樣本處理區(qū)） 所有試劑、樣本使用前置室溫解凍。 8.1 取n個0.5ml滅菌離心管（n = 樣本數(shù)+1管強陽性對照+1管臨界陽性對照+1管陰性對照），作好標記。 8.2 在上述每一個管中加入150ul裂解液，然后加入待測樣本和陰性對照50ul，強陽性對照管和臨界陽性對照管中先加入強陽性對照和臨界陽性對照25ul，然后加入陰性對照管中的血漿25ul(切不可將二者混合后加入)，用吸頭反復吸打混勻（一份樣本換用一個吸頭）；再加入50ul氯仿，混勻器上振蕩混勻5sec或顛倒

17、混勻15次（不宜過于強烈，以免產(chǎn)生乳化層）。 8.3 13,000rpm離心15min（如有條件，于4進行離心）。 8.4. 取與步驟2.1.中相同數(shù)量的0.5ml滅菌離心管，各加入100ul異丙醇和2ul RNasin，作好標記。吸取步驟2.3.各管中的上層液相轉移至相應的管中（注意不要吸出中間層，該層富含DNA和蛋白質），顛倒混勻。 8.5. 13,000rpm離心15min，（注意固定離心管方向）。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體；加入300ul 75%乙醇，顛倒洗滌。 8.6 13,000rpm離心10min（注意固定離心管方向）。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體。 8

18、.7 4,000rpm離心5sec（注意固定離心管方向），將管壁上的殘余液體甩到管底部,用微量加樣器盡量將其吸干（一份樣本換用一個吸頭，注意吸頭不要碰到有沉淀一面），室溫干燥1-5min（不宜過于干燥，以免RNA不溶）。 8.8 加入15ul DEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，2,000rpm離心5sec，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ⒁猓捍藭r的RNA最易受RNase降解，請在2小時內(nèi)用于PCR擴增）。 9、 加樣（樣本處理區(qū)） 9.1 Roche儀器：在各設定的Roche毛細管中分別加入上述樣本處理步驟2.8.中制備的RNA 溶液各15ul，蓋緊管蓋，連同Roche專用金屬反應管套放入離心機中，于

19、2,000rpm離心10sec。將毛細管排好放入Roche PCR熒光檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。 9.2 非Roche儀器：在各設定的PCR反應管中分別加入上述樣本處理步驟1.9.中制備的 RNA溶液各15 ul，蓋緊管蓋，轉移到檢測區(qū)。將反應管排好放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。 10、 PCR擴增（檢測區(qū)） 10.1 循環(huán)擴增條件 10.11 Roche Lightcycler a) 42：30 min； 92：3 min； b) 92：10 sec，52：20 sec(Temperature Transition Rate設為2/sec),72：30sec 5個循環(huán)； c)

20、92：5 sec, 60：30 sec（Acquisition Mode為Single）40個循環(huán)，Analysis Mode為Quantification。 10.12 Roter-Gene2000/3000 a) 42：30 min；95：3 min； b) 95：10 sec，55：30 sec，72：60sec 5個循環(huán)； c) 95：5 sec，60：30 sec，40個循環(huán)；反應體系設為25ul。熒光信號收集設在60。 10.13 PE Gene Amp5700，7700，ABI-7000，7300，Line-Gene, a) 42：30 min；95：3 min； b) 95：1

21、0 sec，55：30 sec，72：60sec 5個循環(huán)； c) 95：5 sec，60：30 sec， 40個循環(huán)；反應體系設為50ul。 10.14 BIO-RAD iCycler a) 42：30 min；95：3 min； b) 95：10 sec，55：30 sec，72：60sec 5個循環(huán)； c) 95：5 sec，60：30 sec， 42個循環(huán)；反應體系設為50ul 10.15 MJ Opticon, a) 42：30 min；95：3 min； b) 95：10 sec，55：30 sec，72：60sec 5個循環(huán)； c) 95：5 sec，60：30 sec， 40個

22、循環(huán)；反應體系設為50ul，熒光信號收集設在60。 10.2 儀器檢測通道選擇 10.21 Roche Lightcycler 選擇F1通道。 10.22 Roter-Gene2000/3000 Acquisiton選擇Fam。 10.23 E Gene Amp 5700，7700，ABI-7000，7300 a) PE Gene Amp 5700是單通道熒光PCR檢測儀，無需選擇檢測通道。 b) PE Gene Amp 7700, ABI-7000，7300 Reporter設為FAM，Quencher設為TAMRA。Passive Reference設為None（ABI-7000，7300

23、）。 10.24 BIO-RAD iCycler 熒光素選擇FAM-490。 10.25 Line-Gene, 選擇F1通道，增益值批間有所不同，應按每批試劑建議值設定。（每一批試劑的增益值詳見試劑盒中給定值） 10.26 J Opticon, a) Opticon是單通道熒光PCR檢測儀，無需選擇熒光通道。 b) Opticon 是雙通道熒光檢測儀，由于實驗只需要單熒光，選擇Single Color Experiment。 11、結果分析條件設定 11.1 Roche Lightcycler 11.11 選擇F1或F1F2通道（建議選擇F1通道），點擊Quantification進入定量分析

24、窗口。 11.12 在Quantification窗口中，設定Analysis 方式為Fit points，Adjustment 方式為 proportional. 11.13 選定Noise band項, 閾值（Noise band cursor）設定以剛好超過正常陰性對照品擴 增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點，且Ct值不出現(xiàn)任何數(shù)值為準. 11.14 也可根據(jù)儀器的實際情況進行調整。 11.2 Roter-Gene2000/3000 閾值(Threshold)設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點，且Ct值無數(shù)值為準。 11.3 PE Gene Amp 5

25、700，7700，ABI-7000，7300 11.31 PE Gene Amp 5700 結果分析時基線（baseline）的確定：取610或615個循環(huán)的熒光信號。閾值(threshold)設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點，且Ct值=40.0為準。 11.32 PE Gene Amp 7700，ABI-7000，7300結果分析時基線（baseline）的確定：取310或315個循環(huán)的熒光信號。閾值(threshold)設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點，且Ct值=40.0為準。 11.4 BIO-RAD iCy

26、cler 11.41 結果分析時基線（baseline）的確定，基線（baseline）取為210或215個循環(huán)的熒光信號，閾值(threshold) 設定原則以閾值線剛好超過陰性對照品擴增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點，且Ct值=0.0為準。 11.42 也可根據(jù)儀器噪音情況在15.040.0之間調整。 11.5 Line-Gene, 11.51 點擊數(shù)據(jù)分析進入結果分析界面。 11.52 選擇樣點擬合法進行結果分析：零點調整取110或115個循環(huán)的熒光信號；在噪聲容限界面下調整基線位置，其設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增線（無規(guī)則的噪音線）的最高點為準。 11.53 選擇定量分析

27、，對樣本進行結果分析。 11.6 MJ Opticon, 11.61 點擊Quantitation進入結果分析窗口 11.62 在Option選項區(qū)域進行基線以及閾值線的調整。 11.63 取為210或215個循環(huán)的熒光信號，閾值(threshold) 設定原則以閾值線剛好超過陰性對照品擴增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點，且Ct值顯示為none為準。 11.64 也可根據(jù)儀器噪音情況在15.040.0之間調整。 11.65（在用PE5700/7700,ABI-7000,7300/BIO-RAD, Opticon,/ Line-Gene, iCycler熒光定量PCR檢測儀進行分析的過程中，為避

28、免漏檢強陽性樣本，應首先將基線定為610/310/210/110個循環(huán)的熒光信號觀察分析Ct值，如果沒有Ct值16.0的樣本，則將基線改定為615/315/215個循環(huán)的熒光信號進行結果分析；如有Ct值16.0的樣本，則應將該樣本剔除此次結果分析，同時仍將基線改定為615/315/215/115個循環(huán)的熒光信號進行結果分析。） 12、質控標準 12.1 將校準品14的拷貝濃度輸入，儀器將自動以校準品拷貝濃度的對數(shù)值為橫坐標，以其實際測得的Ct值為縱坐標給出標準曲線。 12.2 標準曲線的擬和度應-0.980，否則視為定量結果無效。 12.3 陰性對照HIV RNA應為0.0copies/ml（

29、Ct值一欄無數(shù)值顯示）； 12.4 強陽性對照Ct值25.0； 12.5 強陽性對照Ct值臨界陽性對照Ct值30.0； 12.6 否則實驗視為無效。所有實驗從樣本處理開始重做。 13、結果判斷 13.1 檢測樣本中HIV RNA5.0×103copies/ml，報告相應的拷貝數(shù)。 13.2 檢測樣本中HIV RNA1.0×108copies/ml，可按實際測得值報告相應的拷貝數(shù)，亦可將該樣本用正常人血漿按稀釋到本試劑盒定量檢測線性范圍內(nèi)后重新測定。 13.3 檢測樣本中5.0×102copies/mlHIV RNA5.0×103copies/ml，表明病

30、毒載量較低，該拷貝數(shù)僅供參考，可報告相應的拷貝數(shù)，并應對此份標本謹慎跟蹤。 13.4 檢測樣本中HIV RNA5.0×102copies/ml，表明病毒載量較低，該拷貝數(shù)僅供參考，應一律報告為小于5.0×102copies/ml，并應對此份標本謹慎跟蹤。 13.5 檢測樣本中HIV RNA為0.0copies/ml，報告為小于最低檢出極限。 14、試劑盒性能 14.1檢測限度 經(jīng)采用CLB（荷蘭血液傳輸中心實驗室）HIV RNA monitor（Cat.No. S2039，標定HIV RNA載量為25,000 copies/ml）測試，靈敏度達到5.0×102copies/ml。 14.2 特異性 該試劑盒對HAV、HBV、HCV、HDV、TTV、CT、NG、HSV、HCMV、HPV、UU、TB標本以及獻血員血漿標本均無非特異性擴增。 14.3 定量檢測線性范圍 本品的定量檢測線性范圍為5.0×