重要植物病原細(xì)菌的高通量分子檢測(cè)技術(shù)研究及應(yīng)用

1、重要植物病原細(xì)菌的高通量分子檢測(cè)技術(shù)研究及應(yīng)用    英文題名 Development and Application of High-Throughput Plant Pathogen Molecular Detection Technology   關(guān)鍵詞 padlock探針; 高通量; 分子檢測(cè); 植物病原細(xì)菌; 英文關(guān)鍵詞 padlock probes; high-throughput; molecular detection; plant pathogenic bacteria; 中文摘要 在植物的發(fā)病早期快速、準(zhǔn)確鑒定出病原菌,以防

2、止其傳播和流行、減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要的意義。發(fā)展快速、靈敏、高通量的分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)提升我國(guó)植物病害控制水平,尤其是阻止外來農(nóng)林危險(xiǎn)生物入侵、保護(hù)我國(guó)農(nóng)林經(jīng)濟(jì)安全生產(chǎn)與生態(tài)安全有著重要意義。目前基于PCR技術(shù)的分子檢測(cè)方法無法滿足對(duì)大批量樣本檢測(cè)的需要,因此尋找其他的分子檢測(cè)靶標(biāo),發(fā)展植物病原菌高通量檢測(cè)方法,對(duì)完善病原細(xì)菌分子檢測(cè)技術(shù)、提升我國(guó)植物檢疫的技術(shù)水平和提升我國(guó)植物病害控制水平具有重要意義。 高通量是目前植物病原菌分子檢測(cè)的發(fā)展方向,而基于PCR擴(kuò)增的普通分子檢測(cè)方法無法一次檢測(cè)多種病原菌。因此,發(fā)展高通量檢測(cè)方法對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和口岸檢疫具有重要意義。分子探針和DNA陣列技術(shù)等技術(shù)的出

3、現(xiàn)為發(fā)展植物病原菌高通量檢測(cè)提供了新的思路和方法。Padlock探針是一種長(zhǎng)的寡核苷酸探針,其兩端的序列可通過與靶標(biāo)DNA序列互補(bǔ)配對(duì)而使探針結(jié)合成環(huán)狀。Padlock探針不僅具有非常高的特異性,同時(shí)還可與DNA陣列技術(shù)結(jié)合進(jìn)行高通量檢測(cè)。本研究設(shè)計(jì)了6種重要植物病原菌(Erwinia amylovora,Erwinia pyrifoliae, Pantoea stew. 英文摘要 The failure to adequately identify plant pathogens from culture-based morphological techniques has led to t

4、he development of culture-independent molecular approaches. Increasingly, diagnostic laboratories are pursuing fast routine methods that provide reliable identification, sensitive detection 摘要 7-8 ABSTRACT 8-9 引言 10-11 上篇 文獻(xiàn)綜述 11-38     第一章 植物病原菌檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展 12-38     

5、;    1 常用的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù) 13-23             1.1 PCR及其相關(guān)技術(shù) 13-20                 1.1.1 擴(kuò)增病原菌的致病性基因 14           

6、      1.1.2 rRNA-PCR 14-15                 1.1.3 ITS-PCR 15                 1.1.4 tDNA-PCR 15-16     

7、0;           1.1.5 Nest-PCR 16                 1.1.6 Multiplex-PCR 16                 1.1.7 Real-tim

8、e Quantitative PCR 16-19                 1.1.8 rep-PCR 19                 1.1.9 AFLP 19           &#

9、160;     1.1.10 Immuno-PCR 19-20                 1.1.11 IMS-PCR 20             1.2 DNA陣列技術(shù) 20-21          

10、;   1.3 Padlock探針 21-23         2 植物病原菌分子檢測(cè)的具體特點(diǎn) 23-29             2.1 檢測(cè)技術(shù)特點(diǎn) 24-28             2.2 經(jīng)濟(jì)要求 28-29      

11、0;  3 目前植物病原菌分子檢測(cè)的局限 29-30         4 未來植物病原菌分子檢測(cè)展望 30-32         參考文獻(xiàn) 32-38 下篇 研究?jī)?nèi)容 38-70     第一章 重要植物病原菌的高通量分子檢測(cè)技術(shù)研究 40-70         1 材料和方法 42-49      

12、;       1.1 供試菌株 42             1.2 培養(yǎng)基及溶液的配置 42-43             1.3 基因組DNA的提取 43-46             1.4 Padlo

13、ck探針的設(shè)計(jì) 46             1.5 探針的連接與外切酶處理 46             1.6 探針的擴(kuò)增 46-47             1.7 Macroarray高通量檢測(cè) 47      

14、       1.8 探針的特異性和靈敏度驗(yàn)證 47             1.9 對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè) 47-49                 1.9.1 對(duì)市場(chǎng)哈密瓜種子的檢測(cè) 47-48        &

15、#160;        1.9.2 對(duì)寧夏甜瓜樣品檢測(cè) 48                 1.9.3 對(duì)安徽自然發(fā)病越冬的水稻樣品的檢測(cè) 48-49                 1.9.4 對(duì)水稻種子樣品的檢測(cè) 49 &

16、#160;               1.9.5 人工接種發(fā)病的梨葉片的檢測(cè) 49         2 結(jié)果與分析 49-60             2.1 探針設(shè)計(jì)結(jié)果 49-50        

17、0;    2.2 探針的特異性驗(yàn)證 50-51             2.3 探針的靈敏度驗(yàn)證 51-53             2.4 探針的高通量檢測(cè) 53-55             2.5 對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果 55-60

18、                2.5.1 對(duì)市場(chǎng)哈密瓜種子的檢測(cè)結(jié)果 55-56                 2.5.2 對(duì)寧夏甜瓜樣品檢測(cè)結(jié)果 56-57            &#

19、160;    2.5.3 對(duì)安徽自然發(fā)病越冬的水稻樣品的檢測(cè)結(jié)果 57-58                 2.5.4 對(duì)水稻種子樣品的檢測(cè)結(jié)果 58-59                 2.5.5 人工接種發(fā)病的梨葉片的檢測(cè)結(jié)果 59-60  

20、0;      3 討論 60-62         參考文獻(xiàn) 62-70 附錄 利用PCR技術(shù)?；詸z測(cè)瓜類細(xì)菌性果斑病菌 70-80     1.材料與方法 71-74         1.1 參試菌株 71-73         1.2 菌懸液的制備 73     

21、;    1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 73         1.4 PCR體系及反應(yīng)條件 73         1.5 模擬種子帶菌菌體PCR檢測(cè) 73         1.6 對(duì)市售哈密瓜種子的檢測(cè) 73-74     2 結(jié)果 74-76     3.討論 76-78   

22、60; 參考文獻(xiàn) 78-80                 2.5.4 對(duì)水稻種子樣品的檢測(cè)結(jié)果 58-59                 2.5.5 人工接種發(fā)病的梨葉片的檢測(cè)結(jié)果 59-60         3 討論 60

23、-62         參考文獻(xiàn) 62-70 附錄 利用PCR技術(shù)?；詸z測(cè)瓜類細(xì)菌性果斑病菌 70-80     1.材料與方法 71-74         1.1 參試菌株 71-73         1.2 菌懸液的制備 73         1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 73  

24、;       1.4 PCR體系及反應(yīng)條件 73         1.5 模擬種子帶菌菌體PCR檢測(cè) 73         1.6 對(duì)市售哈密瓜種子的檢測(cè) 73-74     2 結(jié)果 74-76     3.討論 76-78     參考文獻(xiàn) 78-80     &

25、#160;           2.5.4 對(duì)水稻種子樣品的檢測(cè)結(jié)果 58-59                 2.5.5 人工接種發(fā)病的梨葉片的檢測(cè)結(jié)果 59-60         3 討論 60-62       

26、  參考文獻(xiàn) 62-70 附錄 利用PCR技術(shù)?；詸z測(cè)瓜類細(xì)菌性果斑病菌 70-80     1.材料與方法 71-74         1.1 參試菌株 71-73         1.2 菌懸液的制備 73         1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 73         1.

27、4 PCR體系及反應(yīng)條件 73         1.5 模擬種子帶菌菌體PCR檢測(cè) 73         1.6 對(duì)市售哈密瓜種子的檢測(cè) 73-74     2 結(jié)果 74-76     3.討論 76-78     參考文獻(xiàn) 78-80            

28、;     2.5.4 對(duì)水稻種子樣品的檢測(cè)結(jié)果 58-59                 2.5.5 人工接種發(fā)病的梨葉片的檢測(cè)結(jié)果 59-60         3 討論 60-62         參考文獻(xiàn) 62-70 附錄 利用PCR技術(shù)?；詸z測(cè)瓜類細(xì)菌性果斑

29、病菌 70-80     1.材料與方法 71-74         1.1 參試菌株 71-73         1.2 菌懸液的制備 73         1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 73         1.4 PCR體系及反應(yīng)條件 73         1.5 模擬種子帶菌菌體PCR檢測(cè) 73