高通量藥物篩選現(xiàn)代檢測技術研究進展_鄭楓_圖文

1、中國科學 : 化學 2010年 第 40卷 第 6期 : 599 610 SCIENTIA SINICAChimica www. scichina. com chem. scichina. com 中國科學 雜志社 SCIENCE CHINA PRESS評 述高通量藥物篩選現(xiàn)代檢測技術研究進展鄭楓 *, 劉文英 , 吳崢藥品質(zhì)量與安全預警教育部重點實驗室 ; 中國藥科大學藥物分析教研室 , 南京 210009*通訊作者 , E-mail: cpu_analyst126. com收稿日期 : 2010-02-08; 接受日期 : 2010-03-05摘要 高通量藥物篩選是發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新藥物的重要技術途

2、徑 . 高通量篩選結(jié)果必須通過適當 的檢測方法才能反映出來 , 檢測技術是實現(xiàn)高通量藥物篩選的基礎 . 本文綜述了近年來有 關光學分析、色譜分析、熱分析、電化學分析、質(zhì)譜、核磁共振等現(xiàn)代檢測技術在高通量 藥物篩選研究中的進展 . 關鍵詞高通量藥物篩選 現(xiàn)代檢測技術1 引言當今的藥物合成研究領域利用組合化學結(jié)合計 算機輔助技術的模式 , 大大加速了候選藥物的合成 速度 , 急劇增加了合成化合物的數(shù)目 , 加上中藥本身 蘊含的龐大天然化合物庫 , 藥物活性篩選的速度與 規(guī)模成為制約新藥研發(fā)的瓶頸環(huán)節(jié) , 因此對高通量 藥物篩選 (high throughput screening, HTS的研究愈

3、顯 重要 13.高通量藥物篩選技術是以分子水平和細胞水平 的實驗方法為基礎 , 采用自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行實驗 過程 , 以靈敏快速的檢測儀器采集實驗數(shù)據(jù) , 再通過 計算機對實驗獲得的數(shù)據(jù)進行分析處理 . 由于高通 量藥物篩選模型中分子、細胞水平上的相互作用 , 只 有采用適當?shù)臋z測方法才能以可視化的形式反映出 來 , 因此高通量的檢測方法是實現(xiàn) HTS 的關鍵技術 之一 4. 本文綜述了 HTS 中現(xiàn)代檢測技術的研究進 展 , 主要涵蓋光學分析、色譜分析、熱分析、電化學 分析、質(zhì)譜、核磁共振等分析檢測技術 .2 光學檢測技術在 HTS 中最常見的篩選方式是以微孔板作為反 應載體 , 將樣品和生

4、物活性分子均勻分布 , 形成混合 狀態(tài)的均相篩選法 (homogeneous screening assay5. 這種篩選方式如果要實現(xiàn)原位檢測 , 則篩選系統(tǒng)本 身必須含有理想的檢測信號 , 用于評價樣品的作用 強弱 , 而且檢測系統(tǒng)能與微孔板反應載體兼容 , 易于 實現(xiàn)篩選操作的自動化 . 光學檢測信號在這方面體 現(xiàn)出了特殊優(yōu)勢 , 以微孔板為基礎的高通量光學檢 測系統(tǒng)可以追溯到最初的酶標儀 , 現(xiàn)在的高通量檢 測儀器兼容的微孔板密度已經(jīng)由最初的 96孔增加到 384孔 , 部分儀器甚至可以使用 1536孔板進行測量 , 大幅度提高了篩選通量 6. 光學檢測技術也由單一的 紫外 -可見光檢

5、測擴大到化學發(fā)光檢測、熒光檢測和 各種光學傳感技術 , 為高通量檢測開辟了較廣泛的 應用領域 .2. 1 紫外 -可見光檢測技術紫外 -可見光檢測技術是酶抑制劑的高通量藥物 篩選中應用最為廣泛的檢測手段之一 7, 主要檢測形 式是通過酶促反應產(chǎn)物的光吸收強度來測定酶活力 , 進而評價不同抑制劑的抑制程度 . 柳軍等 8建立了篩 選降糖藥物的糖原磷酸化酶 (GPa抑制劑高通量篩選 模型 , 依據(jù)磷酸化酶水解糖原后生成的磷酸根與鉬 酸銨 /孔雀綠反應的產(chǎn)物在 655 nm處有特異性吸收的 性質(zhì) . Jimsheena等 9建立的血管緊張素 1轉(zhuǎn)換酶 (ACE抑制劑 HTS 方法 , 其檢測原理是根

6、據(jù) ACE 酶鄭楓等 : 高通量藥物篩選現(xiàn)代檢測技術研究進展600解底物后生成的馬尿酸在 410 nm處有強吸收的這一 特性 .2. 2 化學發(fā)光檢測技術化學發(fā)光檢測技術也在酶抑制劑篩選中得到了 應用 , Guardigli等 10通過酶促反應產(chǎn)物硫膽堿的化學 發(fā)光信號強度來評價乙酰膽堿酯酶 (AChE的活力 , 并據(jù)此原理建立了乙酰膽堿酯酶抑制劑的 HTS 方法 . 與紫外 -可見光檢測技術相比 , 化學發(fā)光檢測技術具 有高靈敏度的優(yōu)勢 , 最近 Aljofan 等 11又將其成功地 應用于抗新型腦炎病毒藥物的高通量篩選中 .2. 3 熒光標記檢測技術檢測手段最為豐富多樣者當屬熒光檢測技術

7、, 除 常規(guī)的熒光強度檢測 (fluorimetry12外 , 基于熒光猝 滅 現(xiàn) 象 的 熒 光 猝 滅 檢 測 (fluorescence quenching, FQ 13、測量熒光分子受偏振光激發(fā)后發(fā)射光偏振 程 度的熒光偏振檢測 (fluorescence polarization, FP14、 測 量由熒光受體向熒光受體能量轉(zhuǎn)移引起光強度變化 的 熒 光 共 振 能 量 轉(zhuǎn) 移 檢 測 (fluorescence resonance energy transfer, FRET15和均相時間分辨熒光共振能 量轉(zhuǎn)移檢測 (homogeneous time-resolved fluores

8、cence resonance energy transfer, HTRF16等多種熒光檢測技 術均在高通量篩選中得到了應用 , 熒光檢測技術適 用范圍也從酶抑制劑 17, 18篩選拓展到以受體 19, 20、離 子通道 21、細胞 22為靶點的高通量藥物篩選 .熒光檢測技術的缺陷在于可產(chǎn)生熒光的化合物 僅為少數(shù) , 對于缺乏熒光活性的篩選系統(tǒng)一般采用 將熒光活性分子與篩選系統(tǒng)內(nèi)分子鍵合標記 , 作為 探針反映樣品的作用情況 23, 24. 這種熒光標記檢測 技術靈活多樣 , 極大地擴展了熒光檢測技術的應用 范圍 , 使其成為 HTS 中應用最為活躍的檢測手段之 一 25. 2005年由國家重

9、大科技專項 “新藥篩選平臺研 究”課題組建立的針對心血管系統(tǒng)藥物靶點的 HTS 平臺 , 就是以熒光標記的熒光偏振檢測技術為基礎 構建的 26. 但值得指出的是生物活性分子鍵合熒光 標記分子后 , 也可能產(chǎn)生構象變化、活性結(jié)合位點的 覆蓋和空間阻礙等不利因素 , 造成生理活性被改 變 27. 比較典型的一個例子是 : Howitz等 28根據(jù)熒光 標記檢測結(jié)果認為白藜蘆醇等多酚抗氧化劑能有效 激活去乙酰化酶 SIRT1, 但隨后 Kaeberlein 等 29和 Borra 等 30的研究分別證實這種激活作用實際上依賴于檢測所用熒光標記試劑 . 因此 , 研究者應對標記技 術有可能造成 HTS

10、 中出現(xiàn)假陽性或假陰性篩選結(jié)果 的問題有足夠的重視 .2. 4 鄰近閃爍分析技術除了熒光標記技術 , 放射性同位素標記技術也 在一些藥物篩選模型上得到了應用 31, 但該技術需 要在檢測前將游離的配體分子過濾分離 , 篩選通量 受 到 一 定 限 制 , 多 結(jié) 合 一 種 稱 為 鄰 近 閃 爍 分 析 (scintillation proximity assay, SPA的檢測技術進行應 用 . SPA技術主要采用一種鍵合有受體分子的熒光微 球 , 當同位素標記的配體與受體分子結(jié)合時 , 放射性 同位素分子與熒光微球之間的距離足夠近 , 此時放 射性同位素發(fā)射出的 粒子能夠激發(fā)微球發(fā)射熒光

11、 , 而游離的同位素標記配體與熒光微球距離較遠 , 不 能激發(fā)熒光 , 因此無需分離游離的和結(jié)合的標記配 體 , 只要通過檢測篩選系統(tǒng)的熒光強度變化就可以 實現(xiàn)受體的親和力篩選 . SPA技術靈敏度高 , 特異性 強 , 已被廣泛應用于以酶、蛋白受體為靶點的 HTS 中 32, 33. 由于放射性同位素的使用可能造成環(huán)境污 染 , 近年來出現(xiàn)以光敏感劑取代放射性同位素激發(fā) 熒光的 Alphascreen 篩選法 , 迅速在酶抑制劑 34及以 細胞 35、 RNA 36為靶點的高通量藥物篩選中得到了 廣泛應用 . 這些技術在檢測原理上都是以熒光檢測 為基礎 , 在應用上也有頗多類似之處 , 比如

12、 HTRF 法 實 際 上 可 視 為 以 鑭 系 元 素 作 為 光 敏 感 劑 的 Alphascreen 篩選法 , 因此廣義而言只是熒光標記檢 測技術的應用拓展 .2. 5 光學傳感器技術鑒于光學標記檢測技術存在著一些固有的缺陷 , 近年來具有非標記檢測特征的光學傳感器技術迅速 成為高通量篩選檢測技術研究中的“寵兒” 37. 目前 應用于藥物篩選的光學傳感器多是通過包被在傳感 器件敏感膜表面 (sensor substrate的生物識別分子 , 與篩選分子特異性結(jié)合時引起傳感器件的光電物理 特性(如光強 , 折射率或電阻等的變化 , 再通過適 當?shù)膿Q能器轉(zhuǎn)換為檢測信號 , 從而定性、定

13、量地檢測 樣品的作用情況 (圖 1 38.光學傳感檢測技術特有的非標記優(yōu)點 , 使得其中 的代表性技術如表面等離子體共振 (surface plasmon resonance, SPR技術 39和反射光干涉 (reflectometric中國科學 : 化學 2010年 第 40卷 第 6期 601圖 1 光學傳感器的檢測原理示意圖 38interference spectroscopy, RIFS40技術已在高通量篩 選結(jié)果驗證中發(fā)揮了重要作用 , 但與傳統(tǒng)的光學檢 測器相比 , 光學傳感器技術的儀器檢測成本較高 , 限 制了該技術的廣泛應用 41. 比如傳感器件用作能量 轉(zhuǎn)換中介時 , 一般

14、需要高純度的光學材料 , 如硅、光 導纖維 , 并經(jīng)過光刻、介質(zhì)沉積、等離子蝕刻等程序 進行修飾 , 價格不菲 ; 同時由于傳感器件又作為篩選 體系的高通量載體 , 這使得光學傳感器篩選通量的 成本異常高昂 , 因此 Cunningham 等 42開始研究易于 增 加 篩 選 通 量 的 傳 感 器 件 如 光 子 晶 體 (photonic crystal, PC, 也有研究者轉(zhuǎn)向價格較為低廉的基于光 化學特性的傳感器 43.3 色譜 -光譜聯(lián)用檢測技術3. 1 親和色譜技術現(xiàn)代色譜法是藥物研究中應用最為活躍的分離 分析技術之一 , 在藥品質(zhì)量控制、新藥研發(fā)、生物醫(yī) 學分析等領域占據(jù)舉足輕重

15、的地位 . 在種類繁多的 現(xiàn)代色譜法分支中 , 有一種利用生物分子間親和力 進 行 分 離 的 液 相 色 譜 技 術 , 稱 之 為 親 和 色 譜 法 (affinity chromatography, AC. 該技術最初主要用于 分離純化蛋白質(zhì)等生物大分子 , 隨著藥物篩選技術 研究的深入 , 親和色譜法在高通量篩選領域的應用 價值開始受到重視 44, 45.高通量篩選中的親和色譜技術 , 常將生物靶分 子固定于基質(zhì)作為固定相 , 在色譜分離過程時樣品 與受體的特異性結(jié)合能力決定了樣品的保留 , 因此 通過保留時間可以直接獲得樣品與受體親和力的信 息 , 從而實現(xiàn)藥物的活性篩選 . 最早

16、應用于藥物活性 篩選當屬模擬生物膜結(jié)構的磷脂膜色譜 (immobilized artificial membrane chromatography, IAMC46, 該法 將磷脂作為色譜固定相 , 用于篩選藥物的親脂性 . 相對于其他生物活性分子 , 磷脂性質(zhì)穩(wěn)定 , 色譜制備較 為方便 , 因此 IAMC 已經(jīng)作為藥物親脂性篩選的有力 手段而廣受認同 , IAMC柱也已有商品化出售 . 另外 一種研究較多的是 HSA 蛋白質(zhì)柱 (immobilized human serum albumin chromatography, HSA柱較早主要應 用于手性化合物的分離 , 近年來開始用于篩選藥物

17、 與蛋白的親合力大小 , 如 Mallik 等 47應用 HSA 柱研 究了維拉帕米兩種對映異構體與人血漿蛋白結(jié)合力 的差異 .隨著色譜技術的發(fā)展 , 親合色譜篩選技術的研 究熱點也層出不窮. 首先是固定化的生物活性分子 種類不斷增加 , 紛紛涌現(xiàn)出以酶 48、 受體蛋白 49、 離 子通道 50為作用靶點的各種色譜篩選模型 . 其次 , 色 譜分離的檢測手段日益多樣化 , 特別是研究者將高 靈敏度的質(zhì)譜檢測器與親和色譜技術聯(lián)用 51, 拓展 了 AC 篩選技術的應用范圍 . 此外 , 隨著親和色譜分 離機制的研究深入 , 也出現(xiàn)了新的親和色譜篩選方 式 , 如 Schiel 等 52以色譜峰

18、的峰寬來研究小分子藥物 與蛋白的結(jié)合速率. 而對于國內(nèi)研究者而言 , 應用 親和色譜進行中藥活性成分篩選無疑是目前最為熱 門的研究領域之一 53. 應該說 , 從篩選通量看 , 親和 色譜法可能很難達到光學檢測技術的規(guī)模 , 但這種 篩選方式的最大優(yōu)勢在于集分離與受體親和力篩選 于一體 , 將其應用于中藥活性成分篩選正是恰如其 分 .3.2 毛細管電泳技術近年來 , 與親和色譜法類似的親合毛細管電泳法 (affinity capillary electrophoresis, ACE54在高通量藥 物篩選應用中開始嶄露頭角 , Lewis等 55應用 ACE 法 快速篩選了 44000多個小分子

19、化合物與新的抗微生物 蛋白靶點的親合力 , Pascoe等 56應用類似的囊泡電動 毛細管電泳法 (vesicular electrokinetic chromatography, VEKC 篩選藥物的親脂性 . 電泳法分離快速、 高效的 特點是 ACE 在高通量藥物篩選應用中的突出優(yōu)勢之 一 , 但是 ACE 采用常規(guī)的紫外檢測時靈敏度較低 , 多需要與質(zhì)譜檢測器聯(lián)用 .親和毛細管電泳法中供篩選的生物活性分子一 般添加在緩沖液中 , 雖然與親和色譜法中的受體固 定化方法相比應用較為簡便 , 但是在運行過程中蛋 白消耗量較大 , 從這一角度看毛細管電泳前沿分析 (frontal analysi

20、s-capillary electrophoresis, FACE可能鄭楓等 : 高通量藥物篩選現(xiàn)代檢測技術研究進展 602更適合于藥物與受體的親和力篩選 . FACE以常規(guī)的 緩沖溶液為分離介質(zhì) , 進樣樣品為平衡的藥物與受 體混合物 , 運行過程中游離的藥物與受體分離 , 經(jīng)檢 測器檢測形成平臺峰 , 利用峰高可以計算游離藥物 的濃度 , 進而求得藥物與受體的親和力大小 (圖 2 57. FACE 提供了一種與 AC 、 ACE 完全不同的篩選方式 , 該法測定平衡狀態(tài)下的親和力也與人體實際生理環(huán) 境更為接近 , 是一種極具特色的受體親和力篩選方 法 . FACE目前已用于藥物與血漿蛋白親

21、和力的篩 選 58, 隨著與芯片電泳 59、 質(zhì)譜 60等聯(lián)用技術的不斷 發(fā)展成熟 , 毛細管電泳前沿分析技術必將在高通量 藥物篩選中發(fā)揮更為重要的作用 .4 質(zhì)譜檢測技術質(zhì)譜法是藥物研究中應用最為廣泛的分析技術 之一 , 特別是以電噴霧離子源 (electrospray ionization, ESI 和基質(zhì)輔助激光解析離子源 (matrix assisted laser desorption ionization, MALDI為代表的現(xiàn)代質(zhì)譜離子 源的出現(xiàn) , 極大地擴展了質(zhì)譜法的分析對象和應用 領域 , 使其成為藥物標靶發(fā)現(xiàn)與確認的重要技術手 段 61. 應用質(zhì)譜法進行藥物篩選可以同時檢

22、測剩余 底物量和生成產(chǎn)物量 , 因而比光學檢測技術能夠提 供更多的樣品作用信息 . 如 Deng 等 62應用質(zhì)譜檢 測技術進行了 MurC 酶抑制劑的篩選 , 方法靈敏度 高、線性范圍寬 , 與傳統(tǒng)的比色法相比避免了大量的假陽性篩選結(jié)果 . 正是具備這些優(yōu)點 , 質(zhì)譜檢測技術 已經(jīng)在以酶 63、 RNA 64、受體蛋白 65為靶點的高通 量藥物篩選中得到了應用 .4. 1 ESI 離子源在 HTS 中應用最多的還是 ESI 離子源及與之類 似的 APCI 離子源 , 但這類離子源難以兼容高離子強 度、含不揮發(fā)性鹽的溶液 , 而藥物篩選體系本身就是 一個含有大量緩沖鹽的系統(tǒng) , 因此質(zhì)譜直接流

23、動注 射分析 (flow injection analysis, FIA技術并不適合于 高通量藥物篩選 , 樣品檢測前需經(jīng)過分離步驟以除 去干擾組分 66.高效液相色譜 -質(zhì)譜 (HPLC-MS聯(lián)用技術是目前 在生物樣本分析中最為常用的一種分離分析技術 , 不過由于色譜分離所需時間一般都需要數(shù)分鐘 , 不 利于提高篩選通量 ; 即使以較短的 HPLC 分析時間 2 min/次為標準計算 , 篩選 384孔樣品仍超過 12 h. 為 了提高篩選通量 , Roddy等 67應用 Waters 公司生產(chǎn)的 四個電噴霧離子源并行于同一質(zhì)譜儀的多重離子源 裝置 (MUX和 Gilson 公司推出的含有多

24、個自動進樣 器的 Multiple Probe進樣裝置 , 四臺液相色譜儀連續(xù)不 斷進樣分析 , 篩選 384孔酶抑制劑樣品的時間在 2 h左右 . 這種高通量篩選模式依賴于多重離子源裝置 , 不僅儀器價格昂貴 , 而且質(zhì)譜檢測靈敏度相應降低 且交叉污染較難避免 .圖 2 FACE 法測定藥物與 HSA 親合力示意圖 : H 1代表藥物對照品進樣分析后的峰高 , H 2代表藥物與 HSA 混合物進樣分析后 游離藥物的峰高 , 兩者比值 f u = H 2/H 1代表了藥物與 HAS 的親和力大小 57中國科學 : 化學 2010年 第 40卷 第 6期 603在其他生物樣品前處理技術中 , 固

25、相萃取技術 (solid-phase extraction, SPE所需樣品量少 , 便于自動 化操作 , 可以大大縮短樣品制備時間 , 處理后的樣品 通過流動注射直接進入質(zhì)譜分析 , 對于質(zhì)譜法的高 通量篩選檢測較為有利 . Ozbal等 68和 Forbes 等 69 應 用 SPE 前 處 理 技 術 分 別 建 立 了 乙 酰 膽 堿 酯 酶 (AChE抑制劑和磷脂酰絲氨酸脫羧酶 (PSD抑制劑 的質(zhì)譜 HTS 模型 . Maxine等 70應用 BioTrove 推出的 帶有快速自動進樣器的 RapidFire 質(zhì)譜儀 , 與 96孔板 固相萃取自動化裝置聯(lián)用后 8 h內(nèi)可以篩選的酶

26、抑制 劑樣本超過 5000個 , 如采用 384孔板篩選通量還可 以進一步提高 . Quercia71應用該技術進行了蛋白激 酶 B(PKB/AKT1抑制劑的高通量篩選 , 并與傳統(tǒng)的 鄰近閃爍分析技術作了比較 , 兩者的篩選結(jié)果較為 接近 , 驗證了這種質(zhì)譜檢測方式在 HTS 中的可行性 . 雖然 SPE-FIA-MS 檢測技術已經(jīng)可在一定程度上滿 足 HTS 的要求 , 但為了避免交叉污染固相萃取柱無 法多次使用 , 再加上本身的價格和高通量篩選必備 的自動化裝置更進一步增加了檢測成本 , 這是目前 制約其廣泛應用的主要障礙之一 .4.2 MALDI離子源從檢測方式上看 MALDI 離子源

27、檢測無需分離程 序 , 與微孔板兼容性更好 , 分析速度和篩選通量較 ESI 離子源更易提高 , 最近在 HTS 中也開始得到應用 . 由于 MALDI 檢測的基質(zhì)組分會對低分子量段的質(zhì)譜 檢測產(chǎn)生干擾 , 不利于檢測小分子底物 72, Jason等 73將 MALDI 離子源與選擇性很高的三重四極桿質(zhì)量分 析器 (MS/MS聯(lián)用后可以有效消除這種干擾 . 隨后 Hofner 等 74將 MALDI-MS/MS技術與 96微孔板聯(lián)用 , 成功用于甘露糖 (1, 3糖蛋白 -1,2-N 乙酰葡糖氨基 轉(zhuǎn)移酶 (mGAT1靶點的高通量親和力篩選 (圖 3, 該 法通過檢測標記物 NO 711含量反

28、映酶活力 , 獲得酶 促反應曲線進而計算樣品與靶點的親和力大小 . 而 Greis 等 75應用傳統(tǒng)的飛行時間質(zhì)量分析器 (TOF同 樣實現(xiàn)了酶抑制劑的高通量篩選 . 這些 HTS 模型在 8 h內(nèi)的樣品篩選數(shù)目都在 9000個左右 , 篩選通量要 顯著高于 ESI 離子源 , 但是 MALDI 離子源的定量重 現(xiàn)性較差 76, 應用該檢測技術的 HTS 模型的篩選質(zhì) 量仍有待進一步評價.圖 3 MALDI 篩選 mGAT1靶點親和力示意圖 745 電化學檢測技術電化學檢測技術作為現(xiàn)代分析技術的重要分支 , 在藥物分析領域有著較為廣泛的應用 . 近年來 , 依托 膜片鉗技術 (patch-cl

29、amp technique的電化學檢測手 段在以離子通道為靶點的高通量藥物篩選中展現(xiàn)出 了獨特優(yōu)勢 77, 78. 細胞膜上的離子通道是一類重要 的藥物篩選靶點 , 作用于離子通道的藥物在很多重 大疾病的治療中發(fā)揮著重要作用 79. 雖然與疾病相 關的離子通道不斷被成功克隆 , 但是對離子通道特 別是以電壓門控離子通道為靶點的高通量篩選一直 受限于合適檢測手段的缺乏 80. 由于離子通道的功 能主要體現(xiàn)在控制細胞內(nèi)外離子的進出 , 因此研究 離子通道功能的最佳方法就是依托膜片鉗技術直接 測定通過離子通道的電流 , 其他的檢測手段如熒光 標記技術只是間接反映這種功能的變化 81.膜片鉗技術一般將

30、玻璃電化學微電極尖端吸附 于細胞膜 , 在微電極尖端的邊緣與細胞膜之間形成 高阻抗封接 , 記錄通過離子通道的微小離子電流 , 從 而研究其功能 . 膜片鉗技術信息含量大、分辨率高 , 被認為是離子通道分析的 “ 金標準 ” 82. 但是該技術 每次只能對單個細胞進行操作 , 且操作步驟繁瑣復 雜 , 因此對高通量膜片鉗技術的開發(fā)成為研究者必 然的選擇 83. 目前研究較多的是以帶有微孔的平面 電 極 板 代 替 傳 統(tǒng) 玻 璃 微 電 極 的 平 板 膜 片 鉗 技 術 (planar patch clamp technique. 平面電極板一般采用鄭楓等 : 高通量藥物篩選現(xiàn)代檢測技術研究

31、進展 604硅、 玻璃、 塑料等絕緣材料為載體 , 在載體上構建 12 µm 的微孔作為電極 , 微孔上方作為細胞外室 , 下方 作為細胞內(nèi)室 , 并輸入細胞內(nèi)液流體 , 再在細胞外室 插入金屬絲構成完整的平板膜片電極 , 測定時將細 胞引導到微孔上與細胞膜形成高阻抗封接 , 這樣就 可以簡便快捷地實現(xiàn)多個細胞同時測定 (圖 4 84, 85. 平板膜片鉗技術的發(fā)展為離子通道活性的大規(guī)模平 行篩選提供了可能 , 因此各大公司紛紛推出以該技術 為基礎的測量儀器 . 較早的商品化儀器是 Molecular Devices 公司生產(chǎn)的 Ionworks 系統(tǒng) , 近來 Karczewski

32、 等 86應用該系統(tǒng)成功建立了以電壓門控的 Kv1. 5鉀離 子通道為靶點的篩選模型 ; Farre87等將 Nation 公司生 產(chǎn)的 Port-a-Patch 系統(tǒng)應用于 HEK 細胞鈉離子通道的 研究 , 顯著提升了篩選通量 . Tao等 88使用 Axon Instrument 公司生產(chǎn)的 PatchXpress 技術平臺研究小分 子化合物對 hERG 鉀離子通道的藥理作用 , 在保證測 量可靠性的同時體現(xiàn)了較高的篩選通量 .應用這些檢測儀器 , 平板膜片鉗技術的篩選通量 可達到 384孔樣品 /h, 已經(jīng)可在一定程度上滿足離子 通道的 HTS 要求 . 然而目前得到應用的篩選模型成功

33、 率普遍在 70%左右 , 而且檢測儀器昂貴 , 特別是實現(xiàn) 高通量檢測的平面電極板價格不菲且難以循環(huán)使用 , 這無疑限制了該技術的進一步應用 . 當然針對上述不 足 , 研究者也仍然在不斷發(fā)展、 改善該項檢測技術 , 我 們有理由相信以電化學檢測為基礎的膜片鉗電極陣列 技術將在離子通道的 HTS 中發(fā)揮更為重要的作用 .6 熱分析檢測技術各種熱分析技術是藥物熔點測定、 純度檢查、 多 晶型分析、 藥物中結(jié)晶水與吸附水確認等新藥研究項 目中不可或缺的重要技術 . 其中差示掃描量熱法圖 4 平板膜片鉗技術工作示意圖 84 (differential scanning calorimetry, D

34、SC是通過測量熱 量變化與溫度、時間之間關系的一種技術 . 以該技術 原理為基礎的等溫滴定量熱法 (isothermal titration calorimetry, ITC目前已經(jīng)在分子識別、蛋白質(zhì) -蛋白 質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì) -小分子相互作用等生物熱動學 研究中得到了廣泛應用 89. 藥物分子與生物活性分 子如蛋白受體、酶之間的相互作用 , 與上述生化反應 一樣往往伴隨著熱量的變化 , 因此將等溫滴定量熱 法作為檢測手段進行高通量藥物篩選日益受到研究 者的重視 90.等溫滴定量熱法的工作原理與常規(guī)差示掃描量 熱法相似 , 只是增加了一個配體滴定模板 (ligand titrant(圖 5.

35、 應用 ITC 法研究藥物分子與受體間相 互作用時 , 常采用一定量的受體分子作為被滴定物 , 而一定濃度的藥物分子作為滴定配體勻速地滴加到 受體分子所處的隔熱罩中 , 同時測量滴定過程中樣 品池 (sample cell和參比池 (reference cell熱量差的變 化 , 獲得滴定熱量差隨時間的變化曲線圖 . 結(jié)合根據(jù) 單點結(jié)合模型所建立的數(shù)學表達式對該變化曲線進 行非線性擬合 , 可求算得到藥物分子與受體之間的 親和力常數(shù) 91. 在上述實驗和數(shù)據(jù)處理模型基礎上 , ITC 法在以核苷酸 92、蛋白受體 93、酶 94為靶點的 藥物快速篩選中得到了一定應用 . 由于 ITC 法不僅能

36、 夠測得體系吉布斯自由能的變化 , 還能夠同時測得 體系中焓變和熵變對吉布斯自由能變化的數(shù)據(jù) , 因 此在測定親和力常數(shù)之外 , ITC法可以提供更多關于 結(jié)合反應特征的信息 . Carbonell等 95應用 ITC 法研究 了他汀類降血脂藥物與 HMG-CoA 還原酶受體靶點 之間的結(jié)合性質(zhì) , 根據(jù)不同藥物結(jié)合反應時焓變和 熵變對吉布斯自由能變化的不同貢獻 , 認為結(jié)合過圖 5 等溫滴定量熱儀工作示意圖 91中國科學 : 化學 2010年 第 40卷 第 6期605程中體系的焓變反映了藥物與受體靶點的特異性結(jié) 合力 , 與藥效相關 ; 而熵變反映了藥物的非特異性結(jié) 合力 , 與藥物的副作

37、用相關 .由于熱效應是各種生物化學反應的本質(zhì)特征之 一 , 因此 ITC 法檢測的應用范圍較廣 ; 而通過 ITC 法 檢測可以研究藥物與受體靶點結(jié)合的特異性 , 這更 是其他檢測技術較難具備的特殊優(yōu)勢 , 凸顯了 ITC 法 在高通量藥物篩選中誘人的應用前景 96. ITC法在 HTS 中應用的主要障礙在于篩選通量的不足 , 即使 采用最新商品化的 Micro Cal微型 ITC 儀進行藥物篩 選 , 一天的篩選容量也僅為 384孔樣品 , 與其他檢測 技術尚有不小差距 97. 加上 ITC 法進行藥物篩選時所 需靶點分子的用量較大 , 因此目前 ITC 法僅在藥物確 證篩選方面發(fā)揮了一定作

38、用 , 要作為 HTS 的常規(guī)檢測 技術仍需要在儀器微型化方面取得進一步的突破 98.7 核磁共振檢測技術核磁共振是指一種核磁矩不為零的原子核 , 在 外磁場的作用下 , 核自旋能級發(fā)生塞曼分裂 , 共振吸 收特定頻率的射頻輻射的物理過程 . 自上個世紀 50年代發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象以來 , 核磁共振技術逐漸成為解 析有機化合物結(jié)構的有力手段 . 近年來隨著高場核 磁共振儀的問世和多維譜技術的成熟 , 核磁共振技 術的應用范圍也從有機小分子拓展到了生物大分子 領域 . 作為目前在原子分辨率下測定溶液中生物大 分子三維結(jié)構的唯一手段 , 核磁共振技術在研究蛋 白質(zhì) -配基相互作用方面具有特殊優(yōu)勢 , 是

39、新藥研發(fā) 的重要研究技術之一 99.在先導化合物確證和優(yōu)化中 , 一般對不同藥物 濃度與蛋白質(zhì)相互作用后、蛋白質(zhì) 1H-15N HSQC (heteronuclear single quantum coherence譜在接近生 理條件下鑒定或驗證候選藥物與靶點親和力的大 小 100, 但對于 HTS 而言 , 費時、昂貴的二維譜并不 適合作為一種常規(guī)的檢測手段 , 研究者一般致力于 將分析時間較短的一維核磁共振譜應用于高通量篩 選 101, 102. Robert等 103提出將 1H-NMR 應用于藥物篩 選的方法 , 其主要原理在于通過滴加受體分子 , 根據(jù) 不同受體濃度對于小分子化合物

40、1H 譜吸收峰強弱的 變化 , 結(jié)合一定的數(shù)學處理模型計算得到親和力的 大小 . 利用該技術測得了 27個化合物與人血清白蛋 白之間的受體親和力 , 并將其與常規(guī)手段測定結(jié)果進行了線性回歸 , 回歸系數(shù)達到 0.81. 通過不同濃度 樣品與檢測信號變化的關系來測定受體親和力的大 小是高通量篩選中常用的篩選形式 , 應用該法時一 般測量 6個濃度點以上樣品 , 以便獲得穩(wěn)定的親和力 常數(shù) . 鑒于核磁共振技術分析速度慢 , 且難以并行檢 測 , 無疑應用單點競爭篩選法更為現(xiàn)實 .單點競爭篩選試驗需要使用一種參比物作為探 針分子 , 通過研究待測樣品對探針分子與受體親和 的競爭程度來推算樣品的受體

41、親和力 , 應用核磁共 振技術時這種競爭程度可通過核磁共振譜中檢測信 號的變化來反映 104. 目前研究較多的一種篩選方式 是 Dalvit 等 105提出的 19F-NMR 競爭篩選法 , 該法通 過測量待測樣品加入前后 19F-NMR 譜共振信號強度 的變化來表征待測樣品對探針分子的競爭置換能力 , 可供檢測的靶點包括了絲氨酸 /蘇氨酸 p21活化激酶、 人血清白蛋白等 106. 這種技術關鍵是需要找到與受 體有一定親和力的 19F 標記探針分子 , 雖然目前 ACD-SC(available chemicals directory-screening compounds 篩選化合物庫中大

42、約 12%的分子含有氟 原子 , 但是很多情況下仍然需要專門合成這種探針 分子 107, 108. 為提高檢測的通用性 , 最近研究者又轉(zhuǎn) 向運用 1H-NMR 競爭篩選法 109, 但是這種方式中的 探針分子與待測樣品之間的譜線往往會發(fā)生重疊 , 實際應用中仍有很大的局限性 .總體來看 , 與核磁共振技術在解析生物大分子 結(jié)構和研究其相互間作用的重要性地位相比 , 核磁 共振檢測技術在高通量藥物篩選中仍未得到廣泛應 用 . 這主要是由于核磁共振技術設備要求高 , 難以并 行檢測 , 且篩選所需受體用量大等限制造成的 . 但是 核磁共振技術從原子核維度提供樣品與受體作用的 信息 , 其價值又是

43、其他檢測技術所不具備的 , 預期未 來會在 HTS 中發(fā)揮更為重要的作用 .8 總結(jié)與展望針對 HTS 的特殊要求 , 一種理想的分析檢測技 術應具備下列特點 : 高通量 ; 原位直接檢測 ; 檢測成 本低 ; 靶點無需標記或修飾 ; 精準地反應篩選結(jié)果 , 避 免 出 現(xiàn) 假 陽 性 或 假 陰 性 結(jié) 果 ; 適 合 初 次 篩 選 (primary screening、深入篩選 (secondary screening和 確證篩選 (confirmatory screening; 適合受體、酶、離 子通道、細胞等多種篩選模型 . 應該說 , 到目前為止鄭楓等 : 高通量藥物篩選現(xiàn)代檢測技

44、術研究進展606并沒有一種檢測技術能完全具備上述特征 , 仍然需 要不斷發(fā)展各種高通量篩選檢測技術 .HTS 中的光學檢測技術具有無需分離即可實現(xiàn) 原位檢測、篩選通量高、檢測成本低、檢測儀器成熟 的突出優(yōu)勢 , 只是篩選系統(tǒng)本身就具有理想的光學 檢測信號的機會并不多 , 因此在高通量藥物篩選中 往往要結(jié)合標記技術以擴展光學檢測的應用范圍 . 這種光學標記檢測技術靈活多樣 , 已成為高通量藥 物篩選中應用最為廣泛的檢測方法之一 . 隨著研究 的深入 , 發(fā)現(xiàn)了生物活性分子鍵合標記分子后 , 可能 引起構象變化 , 活性結(jié)合位點的覆蓋和空間阻礙等 一系列不利因素 , 易造成藥物篩選中出現(xiàn)假陽性與

45、假陰性結(jié)果 .正是由于標記檢測技術在應用中存在著諸多不 足 , 近年來與之相對應的一種稱為非標記檢測技術 (label-free technologies的概念逐漸興起與流行 , 迅速 成為 HTS 研究領域的新熱點 110, 111. 非標記檢測技術 所涵蓋的并不僅限于光學傳感器檢測技術 , 其他的一些檢測技術 , 如質(zhì)譜檢測技術、膜片鉗電極陣列技 術、 熱分析檢測技術等實際上都具有非標記檢測的特 征 . 與光學檢測技術相比較而言 , 這些檢測技術能夠 提供豐富的樣品與靶點作用信息 , 準確地反應篩選 結(jié)果 , 避免了假陽性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn) , 其優(yōu)勢已 不僅是非標記這一點 . 此外 ,

46、解析生物大分子結(jié)構的 重要技術手段如核磁共振技術、 X 射線晶體衍射技 術 112、電子顯微鏡技術 113, 在高通量藥物篩選中的 應用價值也逐漸受到研究者的關注 .非標記檢測技術雖然還受到檢測成本、 檢測通量 等方面的限制 , 目前在高通量藥物篩選中應用范圍 也還沒有光學檢測技術那么廣泛 , 但在一些篩選模 型應用中已經(jīng)體現(xiàn)出了諸多優(yōu)勢 , 完善、發(fā)展這些檢 測技術已被視為未來高通量藥物篩選研究的重要發(fā) 展方向 114. 而這些技術的進一步發(fā)展與應用 , 必將 表明合理運用現(xiàn)代藥物分析技術的重要性 , 在推動 高通量藥物篩選技術發(fā)展乃至創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)中起著 關鍵作用 .致謝本工作得到國家自然科

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