SDS-PAGE電泳常見問題解答

1、1,配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？在SDS-PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是Tris-HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7,分離膠pH8.9;而電泳緩沖液使用 的Tris甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其 pH環(huán)境呈弱酸性，因此 甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而 CL離子卻很 高，兩者之間形成導電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。 由于導電性與電場強度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度， 壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當樣品進入分離 膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增 加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場

2、的作 用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進行分離。所以，pH對整個反應體系的影響是至關(guān)重要的，實驗中在排 除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該因素。2,樣品如何處理？根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原 SDS處 理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原 SDS處理。1）還原SDS處理：在上樣buffer中力口入SDS和DTT （或Beta 航基乙醇）后，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成 SDS與蛋白 相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種 方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer,離心，沸水煮5min, 再離心加樣。2）帶有

3、烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用 可以很好的并經(jīng)久牢固的保護 SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸 胺可捕集過量的DTT,而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液 中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫 30min。3）非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只 用1%SDS沸水中煮3min,未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不 可作為測定分子量來使用。3 . SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用？聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體， 具凝 固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7,分離膠選擇p

4、H8.9,選擇tris HCL系統(tǒng)，TEMED與AP: AP提供自由基，TEMED是催化齊L 催化自由基引起的聚合反應進行；十二烷基硫酸鈉（ SDS）:陽離子 去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋 白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。4 .提高SDS-PAGE電泳分辨率的途徑？聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或 4 度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致 SDS結(jié)晶。一般 凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染 料又各自不同的染

5、色方法，具體可參照郭堯君編著的 蛋白質(zhì)電泳技 術(shù)手冊P82-103。5 .“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致， 多出現(xiàn)于較厚的 凝膠中。處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。6 . “皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳梢中，一般是兩板之間的底部間隙 氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。7 .為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。處理辦法：加樣前離心；選擇適當?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品 促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。8 .為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？主要是樣品

6、不溶性顆粒引起的。處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。9 .什么是“鬼帶”，如何處理？“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn) 在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部 有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分 子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標 條帶有相同的免疫學活性，在WB反應中可見其能與目標條帶對應的抗體作用處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的 DTT或Beta航基乙 醇，以補充不足的還原劑；或可加適量 EDTA來阻止還原劑的氧化。10 .為什么澳

7、酚藍不能起到指示作用？我們在實驗中常會遇到澳酚藍已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未 跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：更換正確pH值的Buffer;降低分離膠的濃度。11 .為什么電泳的條帶很粗？電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。處理辦法：適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）;適當降低電壓；12 .為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？這種現(xiàn)象一般初學者易出現(xiàn)。比如電壓50V以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳梢沒有正確裝配，電流未形成通路。包 括：a.內(nèi)外梢裝反；b.外梢液過少；c.電泳梢底部的絕緣體未去掉（比 如倒膠用的橡膠皮）。處理辦法：

8、電泳梢正確裝配即可。13 .濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳有影響嗎？這主要出現(xiàn)在初學者中，一般對電泳不會有太大的影響。 前者 主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致； 后者是由于在解除制膠的 夾子后，板未壓緊而致空氣進入引起的。14 .凝膠時間不對，或慢或快，怎么回事？通常膠在30MIN-1H內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是 TEMED, APS劑量不夠或者失效。APS應該現(xiàn)配現(xiàn)用，TEMED不穩(wěn)定，易被 氧化成黃色。 如果凝的太快，可能是 APS和TEMED用量過多，此 時膠太硬易裂，電泳時易燒膠。15 .電泳時間比正常要長？可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級緩沖系統(tǒng)地 PH選擇錯誤，即緩 沖系統(tǒng)地P

9、H和被分離物質(zhì)的等電點差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強 度太高。我們實驗室的傳統(tǒng)也是將倒完的膠放在冰箱內(nèi)過夜凝聚，第二天跑膠效果非常好。我想主要原因并不在于低溫，而在于過夜時間長，讓膠 凝聚得非常充分而且均勻。反之，在 37溫箱內(nèi)雖然凝得很快，但是 容易出現(xiàn)膠脆，凝聚不均勻等情況。我想只要你得配液沒問題，那么 適當延長凝膠時間肯定效果會好些！溫度的高低決定了膠聚合的速度：高溫有助于膠的聚合。但是，膠聚 合得越快，其脆性也越大。因此，一般把膠的聚合時間控制在40-60分鐘左右為宜。當然，灌膠后放入4度聚合，具聚合時間會大大延長， 但是其脆性也會大大降低上層的濃縮膠用的是 Tris-HCL緩沖液，PH

10、6.8, HCL的解離度大,幾乎全部成CL-,CL-在電場中移動最快。而電泳梢中含有甘氨酸，在PH6.8時只有少量解離，在電場中移動的最慢。蛋白質(zhì)（被夾在中間）就在由快慢離子形成的電位梯度中被濃縮了。下層的分離膠用的是Tris-甘氨酸緩沖液，PH8.8,在此PH下，甘 氨酸解離度增大，泳動速度增加并超過了蛋白質(zhì)，原先的電位梯度消失，大小形狀不同 的蛋白質(zhì)在電場中分離。電泳結(jié)果的好壞肯定和電泳的條件有關(guān)，我認為應該注意以下幾點：1樣品的純度高，雜質(zhì)含量少，選擇的Loading要正確；2,就是膠的濃度要控制好，看你跑的條帶大小來選擇膠的濃度，特別是 分離膠的濃度！3,就是電壓的選擇，當樣品在濃縮膠

11、里時，可以把電壓調(diào)小點，當?shù)椒蛛x 膠時,電壓可以加大，這樣跑的條帶就清晰！4,點樣品的量要控制好，不能太多，否則就跑成團狀，也不能太少，條帶 不清晰！至于樣品和Marker顯色問題，那要看你用的Marker是預染Marker還 是非預染Marker,如果用的是預染 Marker,那就是跑膠時，Marker條帶 先顯現(xiàn)出來！如果是非預染Marker,那條帶就和樣品一起染色時顯現(xiàn)出 來！SDS-PAGE經(jīng)驗集錦：極其好用2009-06-28 00:17蛋白SDS-PAGE電泳及定量在蛋白質(zhì)技術(shù)手冊5基礎(chǔ)上，根據(jù)實驗條件的方便修改。請仔細看各種細節(jié)改良，各種操作效果經(jīng)本實驗室5年驗證?！疽弧?儲存液

12、配制(注意配方和實際測定參數(shù)！ ！)(1) 2 M Tris-HCl (實測 pH 8.9±0.1, 25C) 500 mL: 121 g Tris base 加350 mL雙蒸水溶解，以玻璃棒攪拌約1 min,緩慢加入濃鹽酸(11.8 M) 20 mL,繼續(xù)攪拌均勻，并使Tris全部溶解，溶液澄清，加入適 量雙蒸水至500 mL,倒入無色玻璃試劑瓶中，4c冰箱保存。(2)100 g/L SDS溶液：10 g SDS (要求高純度，其質(zhì)量明顯影響 電泳效果)加100 mL雙蒸水，于潔凈的250 mL燒杯中進行微波加 熱溶解，注意不要爆沸，間歇用玻璃棒攪拌以加速溶解，完全溶解后 的溶液

13、應清澈透明無色。倒入無色玻璃試劑瓶中，4c冰箱保存。冰箱取出后可微波加熱促進儲存液的溶化。(3) 75% (v/v)甘油：于500 mL量筒中倒入分析純甘油 300 mL, 加雙蒸水100 mL,以一次性塑料手套封口，顛倒量筒使甘油完全溶 解，然后倒入無色玻璃試劑瓶中，4c冰箱保存。(4) 10 g/L澳酚藍溶液：500 mg澳酚藍加雙蒸水50 mL,攪拌溶解， 倒入棕色玻璃試劑瓶中，4 C冰箱保存。不用過濾。用時注意吸取上 層澄清液，不要吸到沉淀。【二】電泳工作液配制(省勁好用！ ！)(1) Acr-Bis液(丙烯酰月溶液)500 mL:于800 mL潔凈的燒杯中， 依次稱取雙丙烯酰胺4 g

14、,丙烯酰胺146 g,緩慢倒入雙蒸水約350 mL, 以玻璃棒緩慢攪拌促進溶解。注意，雙丙烯酰胺粉末易漂浮在空氣中， 所以要稱重時注意周圍空氣流速，稱取丙烯酰胺時可以將燒杯中的雙 丙烯酰胺掩蓋。玻璃棒攪動幅度不要太大以免溶液底部的雙丙烯酰胺 浮起并擴散到空氣中。完全溶解的溶液應清澈無色透明。 待溶解完全 后補加雙蒸水至500 mL,倒入無色玻璃試劑瓶中，4c冰箱可保存10 個月。(2) 4X分離膠緩沖液，500 mL:于500 mL潔凈的量筒中，依次加 入 375 mL 2 M Tris-HCl (實測 pH 8.9 ± 0.1, 25 C), 100 g/L SDS 溶 液(冰箱取

15、出后可微波加熱促進儲存液的溶化)20 mL,最后加入適量雙蒸水至500 mL。倒入無色玻璃試劑瓶中，4c冰箱最少可保存12 個月。有時冰箱溫度過低會使儲存液混濁，微波略微加熱使其澄清后 即可使用。(3) 100 g/L 過硫酸鏤溶液 (ammonium persulfate, AP)20 mL： 2g 過 硫酸鏤加20 mL雙蒸水，倒入無色塑料試劑瓶中，4c冰箱最少可保 存10個月。注意配膠時不要交叉污染 TEMED ,可以以5 mL分裝到 4個無色塑料試劑瓶中分別保存。(4) TEMED成品液：購買后分裝成2或5 mL小管裝使用可避免母 液受到污染。(5) 5X樣品緩沖液，100 mL:依次

16、加入50 mL 75% (v/v)甘油，20 mL 100 g/L SDS 溶液，10 mL 10 g/L 澳酚藍溶液，5 mL 2 M Tris-HCl (實測 pH8.9±0.1, 25C), 5 mL 航基乙醇，9 mL 雙蒸水?；旌夏敢旱谷霟o色玻璃試劑瓶中，4c冰箱至少可保存12個月。可分 裝成10 mL使用，不會使母液受到蛋白污染。(6) 10X 電泳緩沖液，1000 mL： 稱取 10 g SDS, 30 g Tris base, 144g甘氨酸(事先要明確甘氨酸溶液的顏色，選用溶解后澄清無色 的產(chǎn)品)于1000 mL的燒杯中，加水約700 mL溶解，可微波爐加熱(<

17、; 80 C)以促進溶解，注意不要使其沸騰，加熱至燒杯燙手即可，間歇用玻璃棒攪拌。分裝至無色玻璃試劑瓶中，室溫最少可保存6個 月。其pH值約為pH 8.4±0.1?！咀⒁饪墒∪H6.8的濃縮膠緩沖液，用4X分離膠緩沖液pH8.9的 替代即可】【三】12%電泳膠的配制要注意的是，配膠時分離膠的五個組分按下表依次加入潔凈的配制分 離膠的小燒杯內(nèi)，以槍頭攪拌約10-20 sej灌膠后再在膠面上小心地鋪上一幾毫米厚的水層(這可使凝固后的膠面平滑整齊)，然后于37c 凝固15-30 min。而在配膠時濃縮膠只加前三個組分， 混合液要于4c冰箱保存，待分離膠凝固后再取出加入 AP和TEMED溶

18、液，槍頭攪拌均勻，灌膠后插入梳子，然后于 37c凝固15-30 min。凝固的膠連帶其附著的玻璃板用塑料薄膜嚴密包裹可在 4c冰箱保存2-4天，長 時間保存易干膠，要重新做膠。12.5%電泳膠的配制（10mL）Table 12.5% Gel componentsReagentsCondensing gel二塊30% Acr-Bis solution0.67 mL4Keperating gel buffer 2.5 mL pH8.9H2O3.5 mL100 g/L AP50 L人TEMEDSeperating gel4 mL1 mL pH8.92.3 mL305 L5 L4塊30% Acr-Bi

19、s solution8 mL1.35 mL4><Seperating gel buffer5 mL pH8.92 mLpH8.9H2O7 mL4.6 mL100 g/L AP100 l L60 wLTEMED10 L10 M六塊30% Acr-Bis solution 12 mL2.1 mL4><Seperating gel buffer7.5 mL pH8.93 mL pH8.9H2O10.5 mL7 mL100 g/L AP150 l L90TEMED15 區(qū) L15i L其他濃度的電泳膠配制A%電泳膠的配制(10 mL)Table A% Gel component

20、s (10 mL)ReagentsCondensing gel二塊30% Acr-Bis solution0.67 mL4Keperating gel buffer1 mL pH8.9H2O2.3 mL100 g/L AP30 wLTEMEDSeperating gel(A% *10mL ) /30% mL2.5 mL pH8.9補足10mL其中的H2O補足10mL,所用的計算公式為:10mL-2.5mL- (A% *10mL ) /30% mL 。例如6%的配方中，30% Acr-Bis solution 2 mLH2O5.5 mL例如12.5%的配方中,30% Acr-Bis solution4 mLH2O3.5 mL例如15%的配方中,30% Acr-Bis solution5 mLH2O2.5 mL【四】 考馬斯亮藍染色和脫色（極其好用!考馬斯亮藍染色液1000 mL:先稱取考馬斯亮藍R2501.0 g 于1000 mL