脊髓灰質炎減毒活疫苗糖丸(猴腎細胞)

1、脊髓灰質炎減毒活疫苗糖丸（猴腎細胞）Jisuihuizhiyan Jiandu Huo Yimiao Tangwan (Houshen Xibao) Poliomyelitis Vaccine in Dragee Candy (Monkey Kidney Cell), live本品系用脊髓灰質炎病毒、III型減毒株分別接種于原代猴腎細胞, 經培養(yǎng)、收獲病毒液后制成糖丸，用于預防脊髓灰質炎。1 基本要求生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”要求；2 制造2.1 生產用細胞生產用細胞為原代猴腎細胞。2.1.1 細胞管理及檢定應符合“生物制品生產和檢定用動物細胞基質制備及檢定

2、規(guī)程”規(guī)定。生產用猴腎細胞應選自用未作過其他試驗或做過本疫苗檢定的健康獼猴，所用動物須經不少于6周的隔離檢疫，應無結核、B病毒感染及其他急性傳染病，血清中泡沫病毒（foamy）抗體應為陰性。凡有嚴重化膿灶、贅生物以及明顯的肝、腎病理改變者不得使用。2.1.2細胞制備取符合2.1.1項要求的健康獼猴腎臟，經胰蛋白酶消化、分散細胞，置37.0±0.5培養(yǎng)69天長成單層。每只猴制備的細胞為1個細胞消化批，同一天制備的多個細胞消化批為1個細胞批。2.2 毒種2.2.1 名稱及來源生產用毒種為脊髓灰質炎病毒I、II、III型減毒株，可用I、II、III型Sabin株、Sabin純化株、中2株病

3、毒或經批準的其他毒株。 2.2.2種子批的建立 應符合“生物制品生產和檢定菌毒種管理規(guī)程”規(guī)定。2.2.2.1原始種子批 Sabin株原始毒種、型及中2株均由毒種研制單位制備和保存。2.2.2.2主種子批 除WHO贈送的Sabin株外，其他經批準的毒種由原始毒種在胎猴腎細胞或人二倍體細胞上傳12代制成的成分均一的一批病毒懸液稱為主種子批。Sabin株主種子批的傳代水平為SO+1； 中2株主種子批傳代水平為中III2 1代；型pfizer株主種子批為RSO1。2.2.2.3工作種子批 主種子批毒種在原代胎猴腎細胞或人二倍體細胞上傳l代制備成的成分均一的一批病毒懸液稱為工作種子批。2.2.3毒種傳

4、代從原始種子批到生產種子批的傳代次數，Sabin、型和其他純化株以及中2株不得超過3代；Sabin型及其他純化株包括pfizer株不得超過2代。制備生產用種子批所用的細胞應限于原代胎猴腎細胞或人二倍體細胞。2. 2 .4種子批的檢定除另有規(guī)定外，主種子批及工作種子批應進行以下全面檢定2.2.4.1 鑒別試驗取適量型、型或III型單價脊髓灰質炎病毒抗血清與適量病毒供試品混合，置3537中和12小時，接種猴腎細胞、Hep-2細胞或其他敏感細胞，置適宜溫度(3536)培養(yǎng)，7天判定結果，病毒型別應準確無誤。同時設血清和細胞對照，均應為陰性。病毒對照應為陽性。2.2.4.2 病毒滴定采用微量細胞病變法

5、。取毒種作10倍系列稀釋，每稀釋度病毒液接種猴腎細胞、Hep-2細胞或其他敏感細胞，置適宜溫度（3536）培養(yǎng)，7天判定結果。病毒滴度均應不低于 6.5Lg CCID50ml。應同時進行病毒參考品滴定。2.2.4.3 無菌檢查 依法檢查（附錄XII A）， 應符合規(guī)定。2.2.4.4 支原體檢查依法檢查（附錄XII B）， 應符合規(guī)定。2.2.4.5 病毒外源因子檢查依法檢查（附錄XII C）， 應符合規(guī)定。2.2.4.6家兔檢查 毒種液應進行此項檢查，如不立即進行試驗，毒種液應保存于-20以下。取體重為1.52.5kg的健康家兔至少5只，每只注射10ml，用其中1.0ml皮內多處注射，其余皮

6、下注射，觀察3周。到期存活動物數應不低于80，無B病毒和其他病毒感染判為合格。家兔在24小時以后死亡，疑有B病毒感染者應尸檢，須留神經組織和臟器標本待查，用腦組織作10懸液，用同樣方法接種5只健康家兔進行檢查。2.2.4.7 免疫原性檢查用主種子批毒種制成疫苗，按常規(guī)接種易感兒童（免前抗體效價1:4） 至少30名，分別于免疫前及免疫后4周采血，測定中和抗體，免疫后抗體陽轉率應不低于95。2.2.4.8 猴體神經毒力試驗依法檢查（附錄 XI L）， 應符合規(guī)定。2.2.4.9 rct特征試驗將單價病毒液分別于36±0.1及40±0.1進行病毒滴定，試驗設t-對照（生產毒種或已

7、知對人安全的疫苗）。如果病毒液和t-對照在36±0.1的病毒滴度與40±0.1的滴度差不低于5.0 Lg，則 rct特征試驗合格。2.2.4.10 SV40核酸序列檢查依法檢查（附錄IX H）， 應為陰性。2.2.5 毒種保存液體毒種需加終濃度為1mol/L的氯化鎂溶液，置-60以下保存。2.3 原液2.3.1 細胞制備同2.1.2項。2.3.2 培養(yǎng)液細胞培養(yǎng)液為含適量滅能新生牛血清的乳蛋白水解物Earles液或其他適宜培養(yǎng)液。新生牛血清的質量應符合要求（附錄XIII D）。維持液為不含新生牛血清的乳蛋白水解物Earles液或其他適宜的維持液。2.3.3對照細胞病毒外源因

8、子檢查依法檢查（附錄XII C）， 應符合規(guī)定。2.3.4 病毒接種和培養(yǎng)毒種與細胞0.030.3MOI接種（同一工作種子批應按同一MOI接種）， 種毒后置33±0.5培養(yǎng)4896小時至細胞出現完全病變后收獲。2.3.5 病毒收獲同一細胞消化批收獲的病毒液檢定合格后， 經澄清過濾合并為單一病毒收獲液。2.3.6單一病毒收獲液檢定按3.1項進行。2.3.7單一病毒收獲液保存2-8保存不超過30天，于-20保存不超過6個月。2.3.8合并或濃縮同一細胞批制備的多個單一病毒收獲液檢定合格后可適當濃縮進行合并， 經澄清過濾即為單價原液。2.3.9 單價原液檢定按3.2項進行。2.3.10 單

9、價原液保存2-8保存不超過30天。 于-20保存不超過6個月。2.4 半成品2.4.1 配制單價病毒原液加入氯化鎂，終濃度為1mol/L，經除菌過濾后即為單價半成品。取適量I、II、III型單價半成品，按一定比例進行配制，經除菌過濾后即為三價疫苗半成品。2.4.2 半成品檢定按3.3項進行。2.5成品2.5.1疫苗糖丸制備三價疫苗半成品及賦形劑按一定比例混合后制成糖丸。賦形劑成分包括50%還原糖漿、80%糖漿、 脂肪性混合糖粉和單糖粉。滾制糖丸時，操作室內溫度應在18以下。2.5.2 分批應符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。同一次混合的三價疫苗半成品制備的糖丸為一批，非同容器滾制的糖丸分為不同亞批

10、。2.5.3 分裝應符合“生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。2.5.4規(guī)格每粒1g。每次人用劑量為1粒，含脊髓灰質炎活病毒總量應不低于5.95 LgCCID50，其中型應不低于5.8 LgCCID50、型應不低于4.8 LgCCID50、型應不低于5.3 LgCCID50。2.5.5包裝應符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3 檢定3.1單一病毒收獲物檢定3.1.1 病毒滴定 按2.2.4.2 項，病毒滴度應不低于 6.5 Lg CCID50ml。3.1.2 無菌檢查依法檢查（附錄XII A ）， 應符合規(guī)定。3.1.3 支原體檢查依法檢查（附錄XII B）， 應符合規(guī)定。3.2單價原液檢定3.2.1鑒

11、別試驗按2.2.4.1項進行3.2.2病毒滴定 按2.2.4.2 項進行。病毒滴度均應不低于 6.5 Lg CCID50ml。3.2.3無菌檢查依法檢查（附錄XII A ）， 應符合規(guī)定。3.2.4 支原體檢查依法檢查（附錄XII B）， 應符合規(guī)定。3.2.5 猴體神經毒力試驗依法檢查（附錄XI L）， 應符合規(guī)定。3.2.6. SV40核酸序列檢查依法檢查（附錄IX H）， 結果應為陰性。3.3 半成品檢定3.3.1病毒滴定按2.2.4.2項進行。單價疫苗半成品病毒滴度應不低于 6.5Lg CCID50ml。三價疫苗半成品病毒滴度應不低于7.15 Lg CCID50ml，其中I型應不低于7

12、.0 Lg CCID50ml ，II型應不低于6.0 Lg CCID50ml，III型應不低于6.5 Lg CCID50ml。3.3.2無菌檢查 依法檢查（附錄XII A）， 應符合規(guī)定。3.4 成品檢定每個糖丸滾制容器取200300粒。3.4.1 鑒別試驗取適量、III型三價混合脊髓灰質炎病毒免疫血清與適量供試品混合，置3537中和12小時，接種Hep-2細胞或其他敏感細胞，置適宜溫度(3536)下培養(yǎng)，7天判定結果，應無病變出現。同時設血清和細胞對照，均應為陰性。病毒對照應為陽性。3.4.2 外觀應為白色固體糖丸。3.4.3 丸重差異取糖丸20粒測定，重量為1g±0.15g /粒

13、。3.4.4.病毒滴定每3-4亞批合并為1個檢定批，取100粒糖丸，加Earle氏液至1000ml，即為l:10稀釋度采用細胞病變法進行病毒滴定。三價疫苗糖丸以混合法測定病毒含量，同時應以中和法檢測各型病毒含量。采用中和法需預先精確測定異型抗體的交叉抑制值，以校正滴定結果。按2.2.4.2項測定病毒滴度，每劑三價疫苗糖丸總病總量應不低于5.95 LgCCID50，其中型應不低于5.8 LgCCID50，型應不低于4.8 LgCCID50，型應不低于5.3 LgCCID50。3.4.5 熱穩(wěn)定性試驗疫苗出廠前應進行熱穩(wěn)定性試驗， 應與病毒滴定同時進行。37放置48小時后，按2.2.4.2 項進行

14、病毒滴定，每劑量病毒滴度應不低于5.0 LgCCID50，病毒滴度下降應不高于1.0 Lg。3.4.6病毒分布均勻度 每批抽查糖丸10顆以上， 測定疫苗糖丸的病毒分布均勻度。逐顆滴定病毒含量，各顆之間的病毒差不得超過0.5 Lg。3.4.7 微生物限度檢查同天滾制的糖丸為1個供試品，每個糖丸滾制容器取樣不得少于10粒，每粒雜菌數不得超過300個（附錄XII G）。3.4.8 致病菌檢查不得含有乙型溶血性鏈球菌、腸道致病菌以及大腸桿菌。3.4.8.1 乙型溶血性鏈球菌檢查取10倍稀釋疫苗0.5ml接種肉湯1支，37培養(yǎng)24小時，再用劃線法移種血平皿1個，37培養(yǎng)24小時，應無乙型溶血性鏈球菌生長（如原料、輔料已作過此項檢查并合格，成品可不再作）。3.4.8.2 腸道致病菌檢查取10倍稀釋供試品1.0ml接種GN或肉湯增菌培養(yǎng)基1管，37培養(yǎng)，于624小時內用劃線法轉種鑒別培養(yǎng)基平皿