頸椎后縱韌帶膠原、蛋白多糖、鈣含量變化的研究

1、頸椎后縱韌帶膠原、蛋白多糖、鈣含量變化的研究        【摘要】     目的通過定量測定頸椎后縱韌帶總膠原、型膠原、型膠原、蛋白多糖和鈣含量改變，探討頸椎后縱韌帶在頸椎病發(fā)病機理中的意義。方法收集脊髓型頸椎病下位頸椎后縱韌帶15例作試驗組，同年齡段正常下位頸椎后縱韌帶10例作對照，Weossner法測定兩組總膠原含量；酶聯(lián)免疫吸附法測定型、型膠原含量；間苯三酚分光光度法測定蛋白多糖含量；甲基百里香酚藍比色法測定鈣含量；進行HE染色和Masson染色，對比觀察后

2、縱韌帶的顯微結構變化特點。結果試驗組總膠原、型膠原和蛋白多糖含量低于對照組；試驗組型膠原含量較對照組高；試驗組型/型膠原比值低于對照組；試驗組鈣含量較對照組高，組間對比均有統(tǒng)計學意義（P0.05）；病理結構顯示試驗組彈力纖維、膠原纖維腫脹，排列紊亂。結論頸椎病患者頸椎后縱韌帶退變，總膠原、型膠原、型膠原、蛋白多糖和鈣代謝發(fā)生紊亂，頸椎后縱韌帶分子水平的生物化學變化與頸椎病發(fā)生發(fā)展有密切關系。     【關鍵詞】  頸椎?。?后縱韌帶； 膠原； 蛋白多糖； 鈣化    頸椎病是以頸椎間盤退變?yōu)橹饕∽兓A，

3、導致頸周圍肌肉、關節(jié)繼發(fā)性改變和相鄰椎體退變增生而直接壓迫神經血管所誘發(fā)與之相關的臨床癥狀和體征的疾病。后縱韌帶退變在頸椎病的發(fā)病因素中，占重要地位1、2。大量的研究表明頸椎后縱韌帶退變與基因、環(huán)境等多種因素有關。目前國內外對椎間盤及黃韌帶的生物化學水平微量變化進行了大量的研究，但對頸椎后縱韌帶膠原和蛋白多糖等物質生物化學水平定量變化的相關研究鮮見3。    本實驗通過定量測定實驗組和對照組總膠原、型膠原、型膠原、蛋白多糖和鈣含量變化，同時對比觀察兩組顯微病理變化，為頸椎后縱韌帶退變提供分子生物化學量化依據(jù)，并探討頸椎后縱韌帶在頸椎病發(fā)病機理中的意義。 

4、  1  材料和方法1.1  病例選擇  病例組選取本院2005年10月2006年5月收治病人中的15例脊髓型頸椎病手術患者的C4、5或C5、6節(jié)段頸椎后縱韌帶，并去除明顯骨化塊部分，其中男9例，女6例；年齡47歲63歲，平均年齡54歲，頸椎病均根據(jù)臨床癥狀、體征及常規(guī)X線、MRI檢查明確診斷；對照組由東南大學解剖教研室提供，為同年齡段10例生前無糖尿病史、頸肩痛病史、家族性頸椎病史尸體，C4、5和C5、6頸椎后縱韌帶作對照，其中男6例，女4例；年齡4560歲，平均52歲，在死亡后12 h內取材。標本取得后，用生理鹽水沖洗，吸水紙吸干表面的水分，鋁錫紙密

5、封放入-80 冰箱儲存?zhèn)溆谩?.2  主要試劑和儀器  標準羥脯氨酸（Sigma,USA）；酶標器（Bio Red，USA）；型、型膠原酶聯(lián)免疫測定試劑盒（TPI Inc，USA）；甲基百里香酚藍比色法鈣測定試劑盒（南京建成生物技術有限公司，中國）；Masson三色試劑盒（福建邁新生物技術開發(fā)公司，中國）。1.3  Woessner方法測定羥脯氨酸  標本脫水、脫脂、烘干、稱重，加100倍于樣本量6 mol/L鹽酸在110 分解24 h，旋轉蒸發(fā)器去除鹽酸，雙蒸水溶解殘留物，加氯胺T溶液室溫靜置20 min，加過氯酸溶液室溫靜置5 min，加對苯胺基苯甲

6、醛溶液在60 溫箱20 min，取出待冷卻，在波長560 nm處測定吸光值。通過羥脯氨酸標準曲線計算出待測液內的羥脯氨酸濃度，以此推算組織總膠原蛋白含量。1.4  ELISA測定型膠原的含量  標本稱重，脫水脫脂，0.4 mol乙酸浸泡過夜，在冰浴下制備成勻漿，以鹽析法提取膠原。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定型膠原，按試劑盒說明書的步驟進行，在波長450 nm下測定型膠原的濃度，計算含量。1.5  蛋白多糖含量測定方法  采用間苯三酚分光光度法4，測定光密度值，轉換為量值作蛋白多糖含量的測定。1.6  鈣含量測定  標本烘干稱重，研

7、磨成粉末，濃鹽酸高溫分解，蒸發(fā)鹽酸，雙蒸水溶解殘留物，按說明書進行甲基百里香酚藍比色法測定鈣離子含量。1.7  組織病理學觀察  標本用10福爾馬林浸泡過夜，脫水、透明、浸蠟、切片，Masson染色，光鏡觀察。1.8  統(tǒng)計方法  用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包對總膠原、型膠原、型膠原、蛋白多糖和鈣比值的數(shù)據(jù)進行分析，結果以x-±s表示，組間差異比較應用兩組均數(shù)的t檢驗。P0.05表示差異有意義。    2  結果2.1  標本大體觀察  試驗組后縱韌帶質地變硬，彈性減低，色澤發(fā)白，有

8、時可觸及質地硬的骨化塊。對照組后縱韌帶質地柔軟，富有彈性，有光澤，濕潤。    2.2  Woessner方法測定羥脯氨酸結果（表1）    表1  羥脯氨酸和總膠原含量測定（略）2.3  ELISA法測定型、型膠原含量及其比值（表2）表2  型和型膠原含量測定（mg/g）及型/型膠原比值（略）2.4  間苯三酚分光光度法測定蛋白多糖含量和甲基百里香酚藍比色法測定鈣離子含量（表3）表3  蛋白多糖和鈣含量（略）2.5  組織病理學觀察  Masson三色染

9、色膠原纖維呈藍色，彈性纖維呈紅色。實驗組鏡下出現(xiàn)較多的纖維變性區(qū)，彈性纖維減少，甚至呈灶狀缺失，膠原纖維增多，纖維腫脹，界限模糊，外形不規(guī)則，細胞形態(tài)不規(guī)則，排列紊亂，細胞數(shù)較密（圖1、2）。對照組光鏡下頸椎后縱韌帶主要由膠原纖維和彈力纖維組成，纖維呈波浪狀，排列規(guī)則，與韌帶縱軸一致。纖維間細胞稀疏，主要為纖維細胞，細胞成梭形，長軸與纖維走向平行（圖3、4）。  圖1實驗組HE染色（10×20）（略） 圖2實驗組Masson三色染色（10×40）（略） 圖3對照組HE染色（10×20）（略） 圖4對照組Masson三色染色（

10、10×40）（略）3  討論3.1  頸椎后縱韌帶的病理變化  后縱韌帶以膠原纖維及彈性纖維為主，膠原纖維使韌帶組織具有一定的強度和剛度，膠原蛋白含量多少、纖維走行，以及韌帶的形狀尺寸、截面積，與載荷方向一致的纖維數(shù)目多少，纖維寬窄厚薄，決定后縱韌帶的強度5。頸椎后縱韌帶承擔著頸椎的張力載荷，有防止椎間盤后突出和限制脊柱過度前曲的作用，對頸椎穩(wěn)定性有重要作用6。隨著年齡增加，椎間盤退變，椎間隙變窄，椎間不穩(wěn)，椎間異?；顒釉黾樱鄳?jié)段的后縱韌帶受到反復異常刺激。急慢性挫傷時后縱韌帶發(fā)生出血、炎性水腫等一系列病理變化，造成后縱韌帶腫脹肥厚，反復微小出血，血

11、腫機化，甚至發(fā)展到軟骨化或骨化，并成為壓迫脊髓的因素之一。Ono等7通過病理研究顯示頸椎病患者頸椎后縱韌帶基質纖維性和非纖維性組織增生。本組實驗病理觀察顯示，與對照組相比較，病例組頸椎后縱韌帶明顯發(fā)生退性變，其纖維之間的緊密聯(lián)系喪失，纖維排列紊亂，膠原纖維和彈性纖維網斷裂，纖維間隙增寬，細胞形態(tài)不規(guī)則，呈玻璃樣變性，進一步證明頸椎病患者的頸椎后縱韌帶退變。3.2  頸椎后縱韌帶總膠原變化  羥脯氨酸可作為半定量測定總膠原的指標。和黃韌帶、椎間盤等檢測結果不同的是8，本試驗測得的結果顯示，病例組總膠原較對照組減少。退變的頸椎間盤內處于高壓狀態(tài)9，椎體不穩(wěn)，致頸椎后縱韌帶長期處

12、于緊張狀態(tài)，纖維被拉伸，韌帶的血管受到擠壓，血液供應減少，影響韌帶的代謝。缺血缺氧狀態(tài)，妨礙膠原的合成，妨礙組織的修復。據(jù)此，本研究推測椎間盤退變是致頸椎后縱韌帶膠原減少的重要原因之一。    膠原纖維減少及其排列紊亂、斷裂，使后縱韌帶強度和剛度降低。這樣反過來改變原有頸椎生物力學的平衡6，加重頸椎不穩(wěn)，可見頸椎后縱韌帶退變對頸椎病起到惡性循環(huán)的作用。3.3  頸椎后縱韌帶、型膠原含量改變及型型膠原比值意義  型膠原存在于皮膚、韌帶、骨等組織中，型膠原蛋白為軟骨膠原,型膠原作為韌帶的支持物，賦予韌帶以張力；型膠原使韌帶更能承載抗壓應力，二者的比

13、值反應出韌帶的抗張力性能及剛度8。型膠原的分泌與軟骨細胞及類軟骨細胞相關，Yasui等10對正常和頸椎病后縱韌帶膠原分布進行了檢測，發(fā)現(xiàn)肥厚頸椎韌帶的基質內型膠原增加，型膠原主要包繞類軟骨細胞。本試驗檢測到型膠原減少，型膠原增加，實驗組型型膠原比值明顯低于對照組，提示頸椎后縱韌帶呈骨化傾向，進一步提示頸椎后縱韌帶退變嚴重程度。    3.4  頸椎后縱韌帶蛋白多糖和鈣含量變化    蛋白多糖作為韌帶一種重要成分，分子中帶有大量的負電荷，產生一定的固定電荷密度，對水及陽離子具有較大的親和力，其體積龐大，可為組織提供良好的水合空

14、間，可維持后縱韌帶中的水分。蛋白多糖維持膠原纖維排列有序性，防止膠原纖維的降解。蛋白多糖聚合體還可阻止基質的鈣化，使韌帶富有彈性。因此，蛋白多糖聚合體在維持后縱韌帶的生理功能及防止其退變方面都起到重要的作用11。    頸椎后縱韌帶長期處于高張力狀態(tài)是致蛋白多糖分解的重要因素之一，蛋白多糖聚合體的分解而引起水分的丟失。早期可以通過自身的修復重新組合成蛋白多糖聚合體；而當組織發(fā)生變性時，這種修復過程往往不易進行，最后導致后縱韌帶纖維化、骨化，加速后縱韌帶的變形、退變，后縱韌帶組織的黏彈性及對抗壓力減弱。本研究中試驗組蛋白多糖較對照組明顯減少，為頸椎病患者頸椎后縱韌帶

15、的退行性改變提供量化依據(jù)。    因退行性改變，蛋白多糖的分解，以及其他多種因素致使頸椎后縱韌帶鈣過多沉積12，引起后縱韌帶的骨化，試驗組的鈣含量明顯高于對照組，進一步證明了此分子水平的變化。    綜上所述，頸椎間盤退變可促進頸椎后縱韌帶的退變，退變的頸椎后縱韌帶內膠原、蛋白多糖和鈣等含量成分的改變，韌帶骨化，韌帶失去原有的生物學特性，反過來加重了頸椎病。頸椎后縱韌帶在頸椎病的發(fā)展過程中起著重要的作用，希望此試驗的結果能為以后的臨床治療提供一些思路。       

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