血小板源生長因子對大鼠肝星狀細胞增殖和膠原及血小板源生長因子

1、    血小板源生長因子對大鼠肝星狀細胞增殖和 膠原及血小板源生長因子基因表達的影響        摘要目的證實血小板源生長因子(PDGF)對體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞增殖和膠原基因表達及PDGF自分泌的作用。方法（1）采用完全無血清培養(yǎng)，用3H-TdR摻入檢測了PDGF、轉(zhuǎn)化生長因子1(TGF-1)和表皮生長因子(EGF)對肝星狀細胞的DNA合成作用；（2）應(yīng)用Northern分子雜交檢測了PDGF對肝星狀細胞的、型前膠原及PDGF-B等mRNA表達水平的影響。結(jié)果P

2、DGF、EGF均可劑量依賴性地刺激肝星狀細胞增殖，其作用在0.510 ng/ml之間呈劑量依賴性增強，劑量大于10 ng/ml時，促DNA合成作用達到飽和。但PDGF的作用更強。而TGF-1在本實驗條件下對肝星狀細胞的增殖沒有影響。PDGF可提高肝星狀細胞的、型前膠原和PDGF-B的mRNA水平，且前膠原mRNA的改變呈時相性變化。給予PDGF刺激12 h，見型前膠原mRNA表達已有增強，隨后下降，至48 h 型前膠原mRNA表達顯著增強；型前膠原mRNA水平在添加PDGF 12 h即見表達增強，隨后下降，48 h再度低水平增強。體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞可表達PDGF-B mRNA，給予PDGF

3、-BB刺激6 h后，可見PDGF-B mRNA表達增強23倍，至24 h恢復(fù)到刺激前水平。結(jié)論PDGF可以促進肝星狀細胞的增生和表達膠原，后者的時相改變可能與PDGF自分泌有關(guān)。關(guān)鍵詞血小板源生長因子；膠原；基因表達調(diào)控；肝硬化Effects of platelet-derived growth factor on the proliferation of hepatic stellate cells and their expressions of genes of collagens and platelet-derived growth factorLIU XuesongZHANG Ji

4、nshengZHANG Yuee.（Department of Pathology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China）AbstractObjectiveTo investigate the effects of PDGF on the proliferation of rat HSC, its gene expression of collagens and the autocrine excretion of PDGF in vitro. Methods3H-TdR incorporation was used to e

5、stimate the DNA synthesis elicited by PDGF, TGF-1 and EGF in HSC cultured in an absolutely serum-free medium. Northern blot was employed to detect the levels of mRNA expressions of type and procollagens and PDGF induced by PDGF added in the same medium for HSC. ResultsBoth PDGF and EGF enabled to st

6、imulate the proliferation of HSC in a dose-dependent manner, and the effect of the former was stronger. The proliferation was dose-dependently increased in PDGF and EGF with a dosage between 0.5 and 10 ng/ml, and the synthesis of DNA became saturated when the dosage was over 10 ng/ml. TGF-1 gave no

7、effects on the proliferation of HSC under current experimental condition. Furthermore, PDGF was able to enhance the mRNA expression for type and procollagens and PDGF itself. The promoting effect for the expressions of type and procollagen mRNAs by PDGF was bi-phasic between 6 to 48 hours of the cul

8、tivation. For type procollagen, mRNA expression began to increase 12 hours after PDGF stimulation, and the increase became prominent at 48 hours. For type procollagen, an increase of mRNA expression was seen before the stimulation of PDGF, and the expression level was comparatively increased 48 hour

9、s later. The mRNA expression of PDGF was increased by 2-3 times 6 hours after PDGF stimulation, and back to the original level 24 hours later. ConclusionsPDGF enabled to promote the proliferation of HSC and expression of collagens in HSC. The bi-phasic effect on the expression of collagens may be in

10、terrelated with the autocrine excretion of PDGF.Key wordsPlatelet-derived growth factor；Collagen;Gene expression regulation;Liver cirrhosis肝星狀細胞(HSC)又名肝貯脂細胞或Ito細胞,在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。肝損傷因子引起的肝細胞損害可刺激Kupffer細胞釋放血小板源生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)等多種細胞因子，激活肝星狀細胞增生、轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞樣肝星狀細胞，合成、分泌大量細胞外基質(zhì)，參與肝纖維化的發(fā)生。PDGF是機體最重要

11、的促細胞分裂因子，其在動脈粥樣硬化、骨髓纖維化、系統(tǒng)硬化癥以及肺纖維化中的作用多有報道1，雖然體外細胞培養(yǎng)業(yè)已觀察到PDGF有較強的刺激肝星狀細胞增殖作用2，但其實驗使用的是低濃度血清培養(yǎng)基，無法排除血清中其他細胞因子的作用，故我們采用無血清培養(yǎng)基對PDGF的促肝星狀細胞增殖作用做進一步觀察；同時檢測PDGF對肝星狀細胞的、型前膠原和PDGF-B等基因表達的影響。以進一步證實PDGF在肝纖維化發(fā)生中的作用。材料與方法1大鼠肝星狀細胞的分離和培養(yǎng)：依袁桃霞等3方法分離大鼠（SD種,體重400 g左右,本院動物部提供）肝星狀細胞，以105/ml細胞數(shù)接種于48孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶，細胞生長于含20小牛

12、血清、青霉素(100 U/ml)、鏈霉素(100 g/ml)、10 mmol/L Hepes的DMEM培養(yǎng)基(pH 7.0)中，37恒溫, 5 CO2培養(yǎng)(Heraeus培養(yǎng)箱)。48 h換液，去除未貼壁細胞，以后每72 h換液。2細胞增殖的檢測：生長于48孔培養(yǎng)板的肝星狀細胞培養(yǎng)5 d后,換QBSF56無血清培養(yǎng)基（Sigma產(chǎn)品）培養(yǎng)2 d，然后分別加入下列劑量的細胞因子：PDGF-BB（Oncogene公司)、EGF（Sigma公司）、TGF-1（R D Systems公司）各0.5、1.0、5.0、10.0、25.0 ng/ml。每一劑量重復(fù)3孔，同時加入3H-TdR 37 kBq/孔

13、。24 h后中止反應(yīng)，細胞轉(zhuǎn)移至F49濾紙，液閃儀(Beckman公司)計數(shù)cpm。3肝星狀細胞的PDGF處理及總RNA抽提：接種于培養(yǎng)瓶的肝星狀細胞經(jīng)DMEM(含20%小牛血清)培養(yǎng)5 d后，換QBSF56無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，然后添加PDGF-BB 5 ng/ml，分別作用6、12、24和48 h，之后以108細胞經(jīng)原位變性溶解細胞抽提總RNA。經(jīng)RNA定量后，各樣品取10 g總RNA行甲醛變性凝膠電泳，并行Northern印跡后轉(zhuǎn)移至尼龍膜。4.肝星狀細胞、型前膠原及PDGF-B的mRNA表達的檢測：大鼠1 ()和人1()cDNA（由美國康涅狄格大學(xué)David Rowe教授惠贈）及人P

14、DGF-B cDNA（美國密蘇里州血液科腫瘤研究所Lee Rataer教授惠贈）片段長度分別為1.3、0.7和0.45 kb,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化凍存菌液經(jīng)LB培養(yǎng)基擴增后，以堿變性法抽提質(zhì)粒DNA，經(jīng)限制性酶消化后，用透析袋洗脫回收各探針。隨機引物法(Amersham公司)標(biāo)記32P后與肝星狀細胞Northern印跡尼龍膜雜交24 h。X光片-70曝光10 d后顯影。另取甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)-cDNA探針與尼龍膜雜交作為內(nèi)參。結(jié)果1.PDGF對肝星狀細胞增殖的影響：經(jīng)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的大鼠肝星狀細胞經(jīng)不同濃度的PDGF、EGF和TGF-1作用24 h，3H-TdR標(biāo)記法觀察。結(jié)果表明

15、，PDGF和EGF均可促進肝星狀細胞的DNA合成，有明顯的促肝星狀細胞增殖的作用，其作用在0.510 ng/ml之間呈劑量依賴性增強，劑量大于10 ng/ml時,促DNA合成的作用達到飽和。PDGF和EGF相比,前者的促肝星狀細胞增殖的效應(yīng)更為明顯。而TGF-1則沒有促進肝星狀細胞的3H-TdR摻入的作用(1)。1PDGF-BB、EGF、TGF-1對肝星狀細胞3H-TdR摻入的影響2.PDGF對肝星狀細胞的、型前膠原mRNA水平的影響：體外培養(yǎng)肝星狀細胞給予PDGF刺激12 h ，見型前膠原mRNA表達已有增強，隨后下降，至48 h 型前膠原mRNA表達顯著增強；型前膠原mRNA水平在添加PD

16、GF 12 h即見表達增強，隨后下降，48 h再度低水平增強(2)。3.體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞可表達PDGF-B mRNA，在給予PDGF-BB刺激后6 h，可見PDGF-B mRNA表達增加23倍，至24 h恢復(fù)到刺激前水平(2)。討論在病理條件下肝星狀細胞被激活、分化，大量增生并分泌細胞外基質(zhì)，從而成為肝纖維化發(fā)生發(fā)展的主要參與者。肝星狀細胞的激活、增生被認為主要是受Kupffer細胞釋放的多種細胞生長因子所調(diào)節(jié)，Kupffer細胞的培養(yǎng)上清可促進肝星狀細胞的增殖，但這種作用可被抗PDGF抗體阻斷相當(dāng)一部分，顯示了PDGF在促進肝星狀細胞增殖上的重要作用4。PDGF是機體重要的促分裂因子，

17、有A、B兩條肽鏈，通過二硫鏈連接形成，可有AA,BB,AB 3種結(jié)合形式，它通過與靶細胞上的受體結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。PDGF受體也有、兩型, 型受體與A鏈或B鏈結(jié)合, 而型受體則只能與B鏈結(jié)合。研究證明, 大鼠肝星狀細胞只有型受體，只能于PDGF-B鏈結(jié)合5。Pinzani等2曾報道了PDGF對肝星狀細胞增殖的刺激作用，但其實驗中使用的是低濃度血清培養(yǎng)基，這樣在添加PDGF等細胞因子時就沒有完全去除其他細胞因子的影響，其結(jié)果為以PDGF為主的綜合效應(yīng)。本實驗中肝星狀細胞采用了嚴(yán)格的無血清培養(yǎng)，結(jié)果PDGF-BB仍顯示了較強的促肝星狀細胞增殖作用，其10 ng/ml的PDGF-BB對肝星狀細

18、胞的增殖刺激作用比同濃度的另一生長因子EGF強一倍，進一步證實了PDGF對肝星狀細胞的促增殖作用。2PDGF對肝星狀細胞、型前膠原及PDGF-B的mRNA表達水平的影響自從80年代初人們成功分離大鼠肝星狀細胞開始，利用肝星狀細胞體外培養(yǎng)技術(shù)探討其膠原合成作用的研究取得不斷進展，研究結(jié)果表明，體外培養(yǎng)的肝星狀細胞可產(chǎn)生、和型膠原，所以被認為是肝臟主要的膠原合成細胞；已有報道,一些細胞因子如TGF-能促進肝星狀細胞膠原合成6。由于PDGF對肝星狀細胞具有較強的促增殖作用，所以也間接促進了膠原的生成，至于PDGF能否直接促進前膠原基因的表達而增加肝星狀細胞膠原的合成還需實驗證實。本實驗結(jié)果顯示，PD

19、GF可直接引起體外培養(yǎng)肝星狀細胞、型前膠原mRNA的表達水平增加，說明其對膠原的合成也有促進作用。人們早就觀察到了細胞增殖與膠原合成的相伴現(xiàn)象，例如乳腺上皮細胞增殖時的型膠原合成7以及原代培養(yǎng)肝細胞增殖時的、型膠原的合成8，但機理尚不明確。PDGF作為機體重要的促分裂因子，它所引起的肝星狀細胞增殖是否與、型膠原基因的表達相關(guān)，也就是說細胞的生長反應(yīng)基因(growth response gene)與前膠原基因的表達有否內(nèi)在聯(lián)系，這還需要細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的深入研究。至于PDGF引起肝星狀細胞、型前膠原mRNA水平的時相變化，其機理尚不十分清楚，可能與下列因素有關(guān)：（1）mRNA對基因表達的負

20、反饋作用所致，即、型前膠原mRNA的第一次升高對基因的表達產(chǎn)生了抑制作用，前膠原mRNA的表達隨之下降，繼而對基因表達的抑制作用減弱，使前膠原mRNA的表達再度增強。（2）肝星狀細胞PDGF的自分泌作用所致，前膠原mRNA表達的第一次升高是外源性PDGF引起，而第二次升高則是由肝星狀細胞內(nèi)源性的(自分泌的)PDGF引發(fā)。（3）PDGF誘導(dǎo)肝星狀細胞其他細胞因子自分泌的作用所致，例如引起TGF-的自分泌，刺激膠原基因表達增強，出現(xiàn)前膠原mRNA水平的第二次上升。從本文的實驗結(jié)果看,第二種機理的可能性較大。以上結(jié)果提示PDGF在肝星狀細胞參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。（本文編輯：齊文安

21、霍臨明）基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(39670287，39330140)通信作者：張錦生作者單位：劉學(xué)松（上海醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室200032）張錦生（上海醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室200032）張月娥（上海醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室200032）參考文獻：1冉丕鑫. 血小板生長因子研究進展. 國外醫(yī)學(xué)生理、病理科學(xué)與臨床分冊,1993,13:136.2Pinzani M,Gesualdo L,Sabbah GM, et al. Effects of platelet-derived growth factor and other polypeptide mitogens on DNA synth

22、esis and growth of cultured rat liver fat-storing cells. J Clin Invest,1989,84:1786-1793.3袁桃霞,張錦生,張月娥,等.大鼠肝Ito細胞的體外培養(yǎng)及肝素對其抑制作用的觀察. 上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1996,23:90.4Friedman SL,Arthur MJ. Activation of cultured rat hepatic lipocytes by Kupffer cell conditioned medium. Direct enhancement of matrix synthesis and stimulation of cell proliferation via induction of platelet-derived growth factor receptors. J Cli