肺癌組織中蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜分析方法的建立-

1、熱與抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用的優(yōu)勢是利用它們的互補作用,在減少化療藥物用量,降低熱療溫度的情況下保持甚至提高療效,作者認為紫杉醇具備上述優(yōu)點,作為熱化療聯(lián)合應(yīng)用治療口腔頜面部惡性腫瘤的首選化療藥物,有著廣闊的前景。而對于39低藥物濃度作用時出現(xiàn)腫瘤細胞增殖活性明顯增加的現(xiàn)象國內(nèi)外尚未見報道,其機制有待進一步研究。參考文獻1劉寶林,顧曉明主編.口腔頜面外科學.沈陽:遼寧科技出版社,2000.2802韓銳.腫瘤化學預防及藥物治療.北京:北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社,1991.5193van der Zee J.Heating the patient:a p r om ising app r o

2、ach?Ann Oncol,2002,13(8:11734W ester mann AM,Gr osen E A,Katschinski D M ,et al .A p il otstudy of whole body hy perther m ia and carbop latin in p latinu m 2resistant ovarian cancer .Eur J Cancer,2001,37(9:11115Van Heek 2Romanowski R,Putter S,Trarbach T,et al .Et opo 2side t oxicity on human neur o

3、blast oma cells in vitr o is en 2hanced by p receeding hyperther m ia .Med Pediatr Oncol,2001,36(1:1976Monge OR,Rofstad EK,Kaalhus O.Ther moche motherapy invivo of a C3H mouse ma mmary carcinoma:sinigle fracti on heat and drug treat m ent .Eur J Cancer Clin Oncol,1988,24(10:16617Stein U,Jurchott K,W

4、 alther W ,et al .Hyperther m ia in 2duced nuclear transl ocati on of transcri p ti on fact or Y B 21leads t o enhanced exp ressi on of multidrug resistance 2related ABC trans porters .J B i ol Che m,2001,276(30:285628Pazdur R,Kudelka AP,Kavanagh JJ,et al .The taxoids:pacli 2taxel (taxol and docetax

5、el (taxotere .Cancer Treat Rev,1993,19(4:3519Perez E A,Buck walter CA,Reid JP .Combinati ons of pacli 2taxel and et oposide in the treat m ent of lung cancer .Se m in Oncol,1996,23(6Supp l 15:2110Donehower RC,Rowinsky EK,Gr ochow LB,et al .Phase Itrial of taxol in patients with advanced cancer .Canc

6、er Treat Rep,1987,71(12:117111Jordan MA,T os o RJ,Thr o wer D,et al .Mechanis m of m it oticbl ock and inhibit or of cell p r oliferati on by tax ol at l o w concen 2trati on .Pr oc Natl Acad Sci US A,1993,90(20:955212U rano M ,Kur oda M ,N ishi m ura Y .For the clinical app lica 2ti on of ther moch

7、e motherapy given at m ild te mperatures .I nt J Hyperthe m ia,1999,15(2:7913KappelM ,Stadeager C,Tvede N,et al .Effects of in vivohyperther m ia on natural killer cell activity,in vitr o p r olifera 2tive res ponses and bl ood mononuclear cell subpopulati ons .Clin Exp I m munol,1991,84(1:175(20052

8、03210收稿責任編輯姜春霞3河南省自然科學基金資助項目004022300;211工程重點項目腫瘤與生物子項目肺癌組織中蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜分析方法的建立3張慧珍1范清堂1吳逸明21鄭州大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境衛(wèi)生學教研室鄭州4500522鄭州大學公共衛(wèi)生學院勞動衛(wèi)生學教研室鄭州450052男,59歲,教授,博士生導師,研究方向:腫瘤分子生物學關(guān)鍵詞雙向電泳;圖譜分析;蛋白質(zhì)組;P DQuest 軟件;肺腫瘤中圖分類號Q503摘要目的:建立一套雙向凝膠電泳圖像的分析方法,為進一步分析和鑒定差異蛋白奠定基礎(chǔ)。方法:提取肺癌組織和癌旁組織中的可溶性總蛋白,進行雙向凝膠電泳,電泳圖片由專用掃描儀獲取后,

9、應(yīng)用圖像分析軟件(P DQuest 7.1進行蛋白差異點的表達情況分析。結(jié)果:二維電泳圖片經(jīng)過背景消減、點檢測、點匹配等一系列分析后,得出了差異點。結(jié)論:P DQuest 7.1軟件可以用來快速有效地對生物樣品之間蛋白質(zhì)的差異進行分析。Analysis method of t w o 2di m ensi onal gel electr ophoresis i m ages614鄭州大學學報(醫(yī)學版2005年5月第40卷第3期ZHAN G Huizhen1,FAN Q ingtang1,WU Yi m ing21D epart m ent of Environm enta l Health,C

10、ollege of Public Health,Zhengzhou U niversity,Zhengzhou4500522D epart m ent of O ccupational Health and Toxicology,College of Public Health,Zhengzhou U niversity, Zhengzhou450052Key wordst w o2di m ensi onal gel electr ophoresis;i m age analysis;p r oteome;P DQuest s oft w are;lung neop las mAbstrac

11、tA i m:T o establish a t w o2di m ensi onal gel electr ophoresis i m age analysis method f or analyzing the differenti2 ally exp ressed p r oteins.M e tho d s:The whole s oluble p r oteins of tissue of lung cancer and the contr ols were extracted by one step and separated using22di m ensi onal gel e

12、lectr ophoresis.Acquire the i m age and analyze the i m ages using the s oft w are P DQuest7.1.R e su lts:After the backgr ound subtracti on,s pot detecti on and matching,the p r otein s pots which exp ressed differentially were obtained.Co nc l u s i o n:The results of di m ensi onal gel electr oph

13、oresis can be ananlyzed quickly and con2 veniently using P DQuest7.1gel i m age analysis s oft w are.蛋白質(zhì)組學的核心技術(shù)雙向電泳是目前惟一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時分離與展示的技術(shù),在蛋白質(zhì)組的研究中發(fā)揮著重要作用1。其基本思路就是將生物樣品中的蛋白質(zhì)按照所需方法提取出來,通過等電聚焦電泳和十二烷基磺酸2聚丙烯酰胺凝膠電泳(S DS2P AGE將樣品的所有蛋白在一塊凝膠上顯現(xiàn)出來,通過圖像獲取技術(shù)獲得圖像2。那么如何有效地對二維電泳圖像進行分析,挖掘有價值的蛋白質(zhì)信息便成了一個倍受關(guān)注的問題。作者通

14、過研究肺癌組織和癌旁組織之間蛋白的差異情況,采用P DQuest7.1軟件摸索建立了一套成熟的二維電泳圖像分析方法,為下一步對感興趣的蛋白差異點的質(zhì)譜鑒定奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1標本的收集和蛋白質(zhì)的提取實驗采用的肺癌組織和配對的癌旁組織標本均取自鄭州大學第一附屬醫(yī)院,經(jīng)病理學鑒定。提取組織總蛋白3,B radford方法檢測蛋白濃度4,-80保存?zhèn)溆谩?.2固相pH梯度2S D S雙向凝膠電泳使用B I O2 RAD公司的雙向電泳儀。第一相等電聚焦使用的預制膠條pH310。樣品100g中加入上樣緩沖液,總的vh為80000。第二相S DS2P AGE電泳使用120g/L凝膠?？捡R斯亮藍染色

15、。1.3圖像采集與分析軟件使用GS2800獲取圖像后,用P DQuest7.1軟件對圖像進行剪切、編輯、點檢測、點匹配。2結(jié)果2.1圖像獲取利用P DQuest軟件內(nèi)部支持的圖像掃描裝置GS2800進行圖像的獲取。2.2圖像的調(diào)整和背景的消減利用I m age菜單中的剪切(cr op和旋轉(zhuǎn)(r otate功能匹配不同的凝膠所需要的相同尺寸大小和形狀的圖像。在“Transf or m”命令中通過自動或手動最大限度地消減背景,以避免這些背景對二維電泳圖像的分析和實驗結(jié)果的分析的影響。2.3點的檢測和編輯利用軟件中“Spot”菜單的“Spot Detecti on W izard”中的Faint S

16、pot butt on、S mall Spot butt on、Large Spot butt on命令選擇適當?shù)狞c,軟件系統(tǒng)自動設(shè)置檢測參數(shù),點擊Spot Detecti on but2 t on后系統(tǒng)會自動進行點檢測。點檢測完成后可以直接修改檢測的結(jié)果,調(diào)整密度值、點的面積和最低峰值等參數(shù)直至檢測出凝膠上所有感興趣的點。點檢測時還可通過設(shè)置參數(shù)消除電泳過程中出現(xiàn)的橫紋和豎紋,使蛋白質(zhì)呈點狀分布。點檢測后圖像上所有的點的中心都可用十字線表示。點檢測的參數(shù)保存在系統(tǒng)中,用相同方法電泳、染色、掃描得到的圖像可用相同的參數(shù)進行檢測。點檢測的同時可以對點進行編輯,例如刪除一些雜質(zhì)斑點、手工添加一些點

17、、手工合成和分割一些點等等。點檢測完成后,每個蛋白點的編號、峰值、量值和位置都可以顯示出來。凝膠掃描圖像經(jīng)過點檢測后蛋白點會變得更加清晰,而且分析系統(tǒng)還會自動從清晰的點中建立三維的高斯點。經(jīng)過過濾、檢測后,二維圖像就會有三個獨立的圖像:原始掃描圖、過濾圖、高斯圖。2.4點匹配點檢測完成后,軟件系統(tǒng)會自動提示進行匹配(Match。匹配前首先是選擇要比較的一組膠創(chuàng)建Matchest,并選擇一個點較多、能代表整個實驗的,并且膠上的點分布較好、清晰的膠作為標準膠(matchset standard的模板。匹配時要設(shè)立標志點(land mark s pots,P DQuest將landmark s po

18、ts作為參照點去調(diào)整和定位自動匹配的膠,用于彌補膠成員之間輕微的不同和變形。標志點應(yīng)該選擇分辨良好且所有成員膠上均出現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點,并盡量避開蛋白質(zhì)聚集的地方,最好在不同的放大倍數(shù)下714Journal of Zhengzhou University(M edical SciencesM ay.2005Vol.40No.3確定該蛋白質(zhì)斑點為所有成員膠上的同一個蛋白質(zhì)斑點。設(shè)立兩個以上蛋白質(zhì)標志點后,便可進行不同凝膠上蛋白質(zhì)斑點之間的匹配了,在標準膠中的字母表示這些點在其它膠中已被匹配到。P DQuest 軟件還可以用手工方式編輯誤配的或?qū)]有匹配到的點進行手工匹配。肺癌與癌旁組織可溶性蛋白雙向

19、電泳匹配結(jié)果見圖1 。圖1肺癌與癌旁組織可溶性蛋白雙向電泳匹配結(jié)果A:癌旁組織;B:肺癌組織2.5數(shù)據(jù)分析在比較雙向凝膠圖譜時,經(jīng)常有一些由于樣品處理、染色、成像的不同而引起的差異,這些變化不是由蛋白表達引起的。因此要準確定量比較,就必須通過歸一化(Nor malizati on 來彌補這些非表達性的誤差。P DQuest 有幾種歸一化的方法,其中最有效的方法是確定膠之間保守的蛋白,即這些蛋白在所有的膠中都存在且數(shù)量變化不大。在P DQuest 中用Analysis Sets 工具可創(chuàng)建多個Analysis Sets 系統(tǒng),作者利用Analysis Sets 系統(tǒng),比較分析肺癌和癌旁膠之間變化量超過五倍的蛋白質(zhì)點,符合條件的點在膠上標出(圖2 。圖2肺癌與癌旁蛋白表達量差異分析A:肺癌高5倍表達的蛋白點;B:肺癌低5倍表達的蛋白點2.6結(jié)果輸出完成分析工作后,可以根據(jù)自己的需要將實驗數(shù)據(jù)以圖像、表格、圖表、數(shù)字或文字的形式輸出。3討論3.1實驗的重復性與數(shù)據(jù)的可靠性重復性和可靠性是雙向電泳技術(shù)的關(guān)鍵點。實驗中經(jīng)常由上樣、染色等人為因素引起一些非蛋白表達的差異,直接影響到實驗數(shù)據(jù)的可比性。為了更準確地對不同凝膠上的蛋白點進行分析和比較,P DQuest 軟件的歸一化功能可彌補這些非表達性的誤差,讓細胞內(nèi)表達水平一致