第二章蛋白質(zhì)(3)

1、第二章第二章 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(3)2.6. 蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)2.6.1 蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)（1）蛋白質(zhì)的分子量）蛋白質(zhì)的分子量（二）蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)也是兩性電解質(zhì)。 能解離的基團(tuán)除-氨基和-羧基以外，還有側(cè)鏈的-氨基、-羧基、-羧基、咪唑基、胍基、酚基、巰基等。蛋白質(zhì)的兩性解離pH=pIpHpI蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)與其氨基酸的種類和數(shù)量有關(guān)。如魚精蛋白（12-12.4）、胃蛋白酶（1-2.5）。等電點(diǎn)時蛋白質(zhì)溶解度最小，容易聚集而沉淀。因此，可利用此特性進(jìn)行分離、提純。電泳（electrophoresis）帶電的大分子化合物在電場中移動（與

2、帶電荷相反）的現(xiàn)象稱為電泳。蛋白質(zhì)分子電泳的方向和速度取決于其帶電性、電荷多少、分子量以及顆粒大小。電泳法常用于混合蛋白質(zhì)的分離和提純。（三）蛋白質(zhì)的變性（三）蛋白質(zhì)的變性 變性（變性（denaturation）：天然蛋白質(zhì)因受物理或化學(xué)的因素影響，其分子內(nèi)部原有的高度規(guī)律性結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，致使蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)有所改變，但并不導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的破壞，這種現(xiàn)象稱變性作用。 蛋白質(zhì)變性的實(shí)質(zhì)：高級結(jié)構(gòu)被破壞，共價鍵不變，生物活性喪失。 引起蛋白質(zhì)變性的因素：強(qiáng)酸堿、尿素、胍、去污劑、重金屬鹽、三氯醋酸、磷鎢酸、苦味酸、濃乙醇；加熱、紫外線、X射線、超聲波等。變性蛋白質(zhì)的特性變性蛋白質(zhì)的

3、特性（1）生物活性全部或部分喪失 （2）一些側(cè)鏈基團(tuán)暴露，可滴定基團(tuán)增加 （3）一些物理化學(xué)性質(zhì)的改變 （4）生化性質(zhì)的改變變性的可逆性巰基乙醇作為巰基的保護(hù)劑巰基乙醇作為巰基的保護(hù)劑許多蛋白質(zhì)變性時被破壞嚴(yán)重，不能恢復(fù)，稱為不可逆性變性 蛋白質(zhì)變性的應(yīng)用生活常識生活常識1蛋白質(zhì)熱變性的應(yīng)用蛋白質(zhì)熱變性的應(yīng)用 高溫瞬間滅菌；加熱破壞食物中的有毒蛋白，使之失去生理活性； 在加工蔬菜、水果時，先用熱水燙漂，可使維生素C氧化酶或多酚氧化酶變性而失活，從而減少加工過程中維生素C由于酶促氧化的損失和酶促褐變； 在烹飪中在烹飪中 爆、炒、煙等方法，由于進(jìn)行快速高溫加熱，加快了蛋白質(zhì)變性的速度，原料表面因變

4、性凝固、細(xì)胞孔隙閉合，從而原料內(nèi)部的營養(yǎng)素和水分不會外流，可使菜看的口感鮮嫩，并能保住較多的營養(yǎng)成分不受損失。 經(jīng)過初加工的魚、肉在烹制前有時先用沸水燙一下，或在較高的油鍋中速炸一下，也可達(dá)到上述的目的。例如，在制作干燒魚時，先將魚放人熱油中，炸成七成熟后，再放人加有調(diào)味品的湯燒制，不僅魚肉鮮嫩可口，而且形優(yōu)色美，誘人食欲。2蛋白質(zhì)其他變性的應(yīng)用蛋白質(zhì)其他變性的應(yīng)用酸、堿、有機(jī)溶劑、振蕩等因素也會引起蛋白質(zhì)變性，并均可在烹飪中得到應(yīng)用。 蛋白質(zhì)的pH值處于4以下或10以上的環(huán)境中會發(fā)生酸或堿引起的變性， 在制作松花蛋時，就是利用堿對蛋白質(zhì)的變性作用，而使蛋白和蛋黃發(fā)在制作松花蛋時，就是利用堿對

5、蛋白質(zhì)的變性作用，而使蛋白和蛋黃發(fā)生凝固；生凝固； 酸奶飲料和奶酪的生產(chǎn)，則是利用酸對蛋白質(zhì)的變性作用；酸奶飲料和奶酪的生產(chǎn)，則是利用酸對蛋白質(zhì)的變性作用； 牛奶中的乳糖在乳酸菌的作用下產(chǎn)生乳酸，牛奶中的乳糖在乳酸菌的作用下產(chǎn)生乳酸，pH值下降引起乳球蛋白凝值下降引起乳球蛋白凝固，同時使可溶性的酪蛋白沉淀析出。固，同時使可溶性的酪蛋白沉淀析出。酒精和其他有機(jī)溶劑也能使蛋白質(zhì)變性，酒精和其他有機(jī)溶劑也能使蛋白質(zhì)變性， 鮮活水產(chǎn)品的醉腌就是利用這一原理，通過酒浸醉死，不再加熱，即可食用，如醉蟹、醉蝦等。 攪拌攪拌 將蛋白質(zhì)進(jìn)行不斷的攪拌，由于液層產(chǎn)生了應(yīng)力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)被破壞而引起變性，變性

6、后的蛋白質(zhì)肽鏈伸展；由于連續(xù)不斷的攪拌，不斷地將空氣摻入到蛋白質(zhì)分子內(nèi)部中去，肽鏈可以結(jié)合許多氣體，使蛋白質(zhì)體積膨脹，形成泡沫。 如果在較低的溫度或時間較短的情況下進(jìn)行攪拌或振蕩，只能破壞蛋白質(zhì)的三級和四級結(jié)構(gòu)，這種變性是可逆的，如蛋清拍打后產(chǎn)生的泡沫，放置后又可回復(fù)為蛋清。 新鮮蛋品所含的卵粘蛋白較多，經(jīng)過劇烈攪拌后，容易形成泡沫；當(dāng)?shù)捌沸迈r度下降后，卵粘蛋白即分解成糖和蛋白質(zhì)，使整個蛋清變稀薄，從而影響起泡。因此制作蛋泡糊、裝點(diǎn)菜肴或制作糕點(diǎn)時，應(yīng)選用起泡性強(qiáng)的新鮮蛋。 （四）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)相對分子量大，在水溶液中的形成的顆粒具有膠體溶液的特征（布朗運(yùn)動、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象、不

7、能透過半透膜以及具有吸附能力等）。（五）蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)1.加高濃度鹽類鹽析（鹽析（salt out）：高濃度鹽可以破壞蛋白質(zhì)膠體周圍的水膜，同時又中和了蛋白質(zhì)分子的電荷，因此使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀，這種加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象，稱鹽析。如點(diǎn)鹵。2.加有機(jī)溶劑破壞蛋白質(zhì)的親水層。3.加重金屬鹽堿性溶液中與重金屬離子作用而沉淀。4.加某些酸類能和蛋白質(zhì)化合成不溶解的蛋白質(zhì)鹽而沉淀。（六）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)1.雙縮脲反應(yīng)紅紫色紅紫色2.米倫氏反應(yīng)米倫試劑：硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合液。蛋白質(zhì)加入米倫試劑后產(chǎn)生白色沉淀，加熱后沉淀變成紅色。含有酚基的化合物都有此反應(yīng)。3.乙醛酸反應(yīng)蛋白質(zhì)溶液中加

8、入乙醛酸，并沿試管壁緩緩加入濃硫酸，在兩液層之間會出現(xiàn)紫色環(huán)。凡含有吲哚基（色氨酸）的化合物均有此反應(yīng)。H2NCH CCH2OHOOHH2NCH CCH2OHOHN4.坂口反應(yīng)精氨酸分子中的胍基，能與次氯酸鈉及-萘酚在氫氧化鈉溶液中產(chǎn)生紅色產(chǎn)物。5.酚試劑（Folin試劑）反應(yīng)酪氨酸中的酚基能將Folin試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍(lán)色化合物。H2NCH CCH2OHOCH2CH2NHCNH2NHH2NCH CCH2OHOOH（七）蛋白質(zhì)的紫外吸收大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm附近顯示強(qiáng)的吸收與含有哪幾種氨基酸有關(guān)？這些氨基酸在結(jié)構(gòu)上有什么特點(diǎn)？ 蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學(xué)蛋白質(zhì)氨基酸順序的

9、測定是蛋白質(zhì)化學(xué)研究的基礎(chǔ)。自從研究的基礎(chǔ)。自從1953年年F.Sanger測定測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有了胰島素的一級結(jié)構(gòu)以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被測定。上千種不同蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被測定。胰島素胰島素一級結(jié)構(gòu)，即有 21 和 30 個氨基酸組成的 A 、 B 兩條肽鏈種氨基酸的排列順序， 及其中一個鏈內(nèi)兩個鏈間二硫鍵的位置。 測定步驟 1、測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目。 通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。的關(guān)系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。摩爾數(shù)相

10、等，則只有一條；殘基摩爾數(shù)是蛋白質(zhì)倍數(shù)，則為多條。 2、多肽鏈的拆分。多肽鏈的拆分。 由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價鍵力；應(yīng)用過甲氧酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵3、測定氨基酸的組成利用酸水解法完全水解多肽，測定并計算各種氨基酸的分子比！LysMetValCysIlePheThrTrp紙層析圖譜與茚三酮作用4、測定多肽鏈的氨基酸排列順序1）多肽鏈斷裂成多個肽段多肽鏈斷裂成多個肽段， 可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。多肽的選擇性降解多肽的選擇性降解的方法的方法有：酶解法：利用酶選擇性的

11、水解多肽鏈中的某一類肽鍵Lys-Phe-Leu-Arg-Tyr-Trp化學(xué)法：溴化氰水解法，能夠選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基形成的肽鍵！專一性強(qiáng)，分析含甲硫氨酸的肽段的一個理想方法！這個選擇性主要針對羧基端的肽鍵來說的！2）多肽鏈末端氨基酸測定測定N-端氨基和C-端羧基 （重要的是N-端分析法）幾種典型的方法A、二硝基氟苯法（DNFB法，Sanger法）DNP-氨基酸游離氨基酸色譜法鑒定！抽取堿性條件下(H+)B、丹磺酰氯法N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基

12、酸很強(qiáng)的熒光性，靈敏度高可達(dá)10-9堿性條件下C、肼解法（多肽鏈C-端氨基酸分析法）肼化物苯甲醛不溶物3）循環(huán)順序分析法）循環(huán)順序分析法 Edman，1956年，N-端分析法特點(diǎn)：不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離（PTC）（PTC-多肽）（PTH-氨基酸）廣泛應(yīng)用的一種生化分析儀氨基酸順序分析儀自動化程度高可測定只有10-3mg的樣品例題：有一7肽，經(jīng)分析氨基酸的組成是：Lys、Leu、Arg、Phe、Ala、Tyr、Ser；此肽與DNFB反應(yīng)產(chǎn)生DNP-Phe；經(jīng)糜蛋白酶作用，該肽斷裂成游離的Phe和兩個肽段，兩個肽段的氨基組成分別為Ala、 Tyr、 Ser和Leu、

13、 Lys 和Arg，兩個肽段與DNFB反應(yīng)分別產(chǎn)生DNP-Ser和DNP-Lys；（糜蛋白酶只水解芳香族氨基酸的羧基端的肽鍵）此7肽與胰蛋白酶作用，只產(chǎn)生兩個肽段（胰蛋白酶只水解Lys或Arg的羧基端肽鍵）。問：此7肽的一級結(jié)構(gòu)是什么？并簡要寫出分析過程解答：1）與DNFB反應(yīng)產(chǎn)生DNP-Phe，得N端為Phe；2）經(jīng)糜蛋白酶作用，此肽斷裂為Phe和兩個肽段Ala， Tyr， Ser與Leu、Lys、Arg，推測該肽端第四位為Tyr（糜蛋白酶作用點(diǎn)）；3）兩個肽段與DNFB作用分別產(chǎn)生DNP-Ser和DNP-Lys，得該肽第二位為Ser，第三位為Ala，第5 位為Lys；4）此7肽與胰蛋白酶作用，