牛血清白蛋白的分離提純工藝

1、課程設(shè)計(jì)說明書課程名稱：生物分離工程設(shè)計(jì)題目：牛血清白蛋白的分離提純工藝院系：環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院學(xué)生姓名：孫盼盼學(xué)號(hào)：41004020111專業(yè)班級(jí)：10級(jí)生物工程01班指導(dǎo)教師：王曉軍2013年6月20日1. 設(shè)計(jì)任務(wù)書2. 設(shè)計(jì)背景 : 12.1牛血清白蛋白分離提純的簡介 12.2 牛血清白蛋白分離提純的意義 13. 設(shè)計(jì)原理 24. 設(shè)計(jì)工藝流程及設(shè)計(jì)方案說明 24.1 對(duì)原材料的粗分級(jí)分離 34.2對(duì)粗分離成分進(jìn)行細(xì)分級(jí)分離 34.3 蛋白的結(jié)晶與重結(jié)晶 34.4 對(duì)分離出的蛋白質(zhì)進(jìn)行純度鑒定 .34.5牛血清白蛋白質(zhì)分離提純的整個(gè)工藝流程 35. 操作過程 45.1 蛋白質(zhì)分離的準(zhǔn)備

2、階段 45.2 細(xì)分級(jí)分離設(shè)備的設(shè)計(jì) .45.3蛋白質(zhì)的純度鑒定 86. 參考文獻(xiàn) 8課程設(shè)計(jì)心得1.設(shè)計(jì)任務(wù)書現(xiàn)有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量： 57000Da pl 4.5 ）、B -乳 球蛋白（分子量：35000Da pl 5.1 ）、a -乳白蛋白（分子量：14000Da pl 4.2 ）和牛血清白蛋白（分子量：66200Da pl 4.7），設(shè)計(jì)一個(gè)分離純化工 藝純化其中的牛血清白蛋白。2. 設(shè)計(jì)背景2.1牛血清白蛋白分離提純的簡介蛋白質(zhì)是（protein ）是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。因 此，它是與生命及與各種形式的生命活動(dòng)緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)。機(jī)體中的 每一個(gè)細(xì)胞

3、和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)參與。蛋白質(zhì)占人體重量的 16%20%即一個(gè)60kg重的成年人其體內(nèi)約有蛋白質(zhì) 9.612kg。人體內(nèi)蛋白 質(zhì)的種類很多，性質(zhì)、功能各異，但都是由20多種氨基酸按不同比例組合而成的，并在體內(nèi)不斷進(jìn)行代謝與更新。蛋白質(zhì)具有很多生物化學(xué)共性，運(yùn)用相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離制備多 種不同的單一蛋白質(zhì)，更好的為人們所有。蛋白質(zhì)的分離提純技術(shù)已經(jīng)很成 熟，相關(guān)的工藝流程包含各種不同的分離提純設(shè)備，這些設(shè)備運(yùn)用蛋白質(zhì)的 不同原理對(duì)其進(jìn)行分離純化，單一蛋白質(zhì)的分離提純在現(xiàn)實(shí)生活中具有重要 意義！2.2牛血清白蛋白分離提純的意義牛血清中的簡單蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml

4、）,分子量68kD。 等電點(diǎn)4.8。含氮量16%含糖量0.08%。僅含已糖和已糖胺，含脂量只有 0.2%。白蛋白由581個(gè)氨基酸殘基組成，其中35個(gè)半胱氨酸組成17個(gè)二硫鍵，在肽鏈的第34位有一自由巰基白蛋白可與多種陽離子、陰離子和其他小分子物質(zhì)結(jié)合。血液中的白蛋白主要起維持滲透壓作用、PH緩沖作用、載體作用和營養(yǎng)作用。在動(dòng)物細(xì)胞無血清培養(yǎng)中，添加白蛋白可起到生理和 機(jī)械保護(hù)作用和載體作用。牛血清白蛋白（BSA,又稱第五組分，是牛血清 中的一種球蛋白，包含583個(gè)氨基酸殘基，分子量為66200Da等電點(diǎn)為4.7 < 牛血清白蛋白在生化實(shí)驗(yàn)中有廣泛的應(yīng)用，例如在 western blot中

5、作為 Block ing age nt 。3. 設(shè)計(jì)原理采用等電點(diǎn)沉淀、凝膠過濾、親和層析等方法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離提純， 對(duì)相關(guān)分離提純所需條件可通過與電腦相連的方式進(jìn)行精確控制，并在此基礎(chǔ)設(shè)計(jì)相關(guān)儀器分離提純蛋白質(zhì)，在分離提純過程中運(yùn)用到的蛋白質(zhì)一些性 質(zhì)：分子大小、溶解度、等電點(diǎn)、吸附特性等。根據(jù)生物分離原則：先純化，再脫鹽，最后成品加工。初步純化采用鹽 析沉淀法，高度純 化采用二維電泳。鹽析沉淀原理：蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與 水形成水化膜的程度，以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當(dāng)用中性鹽 加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對(duì)水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周 圍的水

6、化膜層減弱乃至消失。同時(shí)，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強(qiáng) 度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋 白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。4. 設(shè)計(jì)工藝流程及設(shè)計(jì)方案說明4.1對(duì)原材料的粗分級(jí)分離當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)提取液獲得后，選用一套適當(dāng)?shù)姆椒?，將所要的蛋白質(zhì)與其他 雜蛋白分離開來。一般該步分離用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等 方法。4.2對(duì)粗分離成分進(jìn)行細(xì)分級(jí)分離這一步也就是樣品的進(jìn)一步純化。樣品經(jīng)粗分級(jí)分離以后，一般體積較 小，雜蛋白大部分已被除去。進(jìn)一步純化，一般使用層析法，還可以選用電 泳、等電聚焦作為最后的純化步驟。等電聚焦電泳就是使電泳的介質(zhì)中形成一定范圍的pH梯度，

7、電泳時(shí)待分離的兩性分子可以在這種pH梯度中遷移，直到聚集于與其等電點(diǎn)相同的 區(qū)域。該技術(shù)特別適用于分子量相近而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)分離和分析。我們在設(shè)計(jì)完成自己創(chuàng)新的蛋白質(zhì)電荷分離儀時(shí)就是依據(jù)等電聚焦的 相關(guān)原理完成的，因此等電聚焦電泳分離蛋白質(zhì)就是我們設(shè)計(jì)分離蛋白質(zhì)的 基本依據(jù)。4.3蛋白的結(jié)晶與重結(jié)晶結(jié)晶是蛋白質(zhì)分離純化的最后步驟，結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結(jié)晶又可除去少量夾雜的蛋白質(zhì)。結(jié)晶并不能保證蛋白質(zhì)一定是 均一的，但只有某些蛋白質(zhì)在溶液中數(shù)量上占優(yōu)勢時(shí)才能形成結(jié)晶。4.4對(duì)分離出的蛋白質(zhì)進(jìn)行純度鑒定蛋白質(zhì)純度鑒定通常采用物理化學(xué)的方法，如電泳、沉淀、HPLC和溶解度分析

8、等。純的蛋白質(zhì)和還有雜質(zhì)的蛋白質(zhì)在電泳等測量時(shí)會(huì)表現(xiàn)出不同的 動(dòng)向故而能夠進(jìn)行純度的鑒定。4.5牛血清白蛋白質(zhì)分離提純的整個(gè)工藝流程工藝流程：動(dòng)植物組織或細(xì)胞，細(xì)菌細(xì)胞裂解破碎T得到蛋白質(zhì)提取液 T通過鹽析、等電點(diǎn)沉淀等方法除去其中的雜質(zhì)T的到體積較小，雜蛋白較 少的蛋白提取液T經(jīng)過層析、電泳、等電聚焦等方法進(jìn)一步分離純化蛋白T 結(jié)晶T重結(jié)晶T純度的鑒定T純度過低時(shí)重復(fù)以上幾步操作T得到單一牛 血清白蛋白5. 操作過程5.1蛋白質(zhì)分離的準(zhǔn)備階段方法：鹽析其原理由于大量中性鹽的加入使水的活度降低，原來溶液中的大部分甚至全部的自由水變成了鹽離子的水化水， 那些被迫與蛋白質(zhì)表面的疏水基團(tuán) 接觸并掩蓋

9、它們的水分子成為下一步最自由地可以利用的水分子，因此留下暴露出來疏水基團(tuán)的蛋白質(zhì)，隨硫酸銨的進(jìn)一步加入，蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)進(jìn)一一 步暴露，由于疏水作用蛋白質(zhì)聚集沉淀。在上步溶有蛋白質(zhì)的緩沖液內(nèi)加入中性鹽硫酸銨，隨著硫酸銨的加入， 當(dāng)離子濃度足夠高時(shí)，緩沖液中的蛋白質(zhì)會(huì)沉淀下來，這樣就得到了蛋白質(zhì) 的粗提物，這步主要利用了鹽析原理。通過以上兩個(gè)步驟完成蛋白質(zhì)的初級(jí)分離，為下一步細(xì)分級(jí)分離做好準(zhǔn) 備。5.2細(xì)分級(jí)分離設(shè)備的設(shè)計(jì)基于蛋白質(zhì)分離的準(zhǔn)備階段，對(duì)所要的目的蛋白進(jìn)行分離創(chuàng)新設(shè)計(jì)儀器名稱：蛋白質(zhì)電荷分離儀所設(shè)計(jì)儀器原理：蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)溶液中帶電，在外加電場作用下會(huì) 向相反電極移動(dòng)；蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)

10、時(shí)溶解度最低且不帶電荷，在外加電場下 不會(huì)移動(dòng)。精確控制分離緩沖液的pH,利用電泳作用分離帶點(diǎn)蛋白質(zhì)和不帶 電蛋白質(zhì)。主要過程包括以下兩方面要點(diǎn)：a、精確地控制反應(yīng)容器內(nèi)液體的pH, b、 自由電泳分離帶電蛋白質(zhì)。所用器材：滴定管、鐵架臺(tái)、夾子、帶孔玻璃板、下部帶有出口圓形玻 璃器皿、磁力攪拌器、pH計(jì)、電腦、電極、電源、透析紙袋等。蛋白質(zhì)電荷分離儀的主要構(gòu)成：固定裝置、反應(yīng)裝置、攪拌裝置、控制 裝置、電泳裝置。儀器介紹：a. 固定裝置主要組成：鐵架臺(tái)、夾子、玻璃板等主要用途：用于固定滴定管，方便調(diào)節(jié) pH的液體（酸、堿、水）的滴 加，再者固定與電極相連的電線，使裝置處于相對(duì)比較穩(wěn)定的狀態(tài)。此

11、裝置 位于分離儀器的最上部。b. 反應(yīng)裝置主要組成：下部帶有出口圓形玻璃器皿、透析紙袋等主要用途：用于盛裝反應(yīng)液，pH計(jì)測定反應(yīng)液的pH,電泳過程等主要 反應(yīng)過程都在這里面進(jìn)行。此裝置位于分離儀器的中部。c. 攪拌裝置名稱：磁力攪拌器原理：利用磁性物質(zhì)同性相斥的特性，通過不斷變換基座的兩端的極性 來推動(dòng)磁性攪拌仔轉(zhuǎn)動(dòng)。適用于粘稠度不是很大的液體，或者固液混合物利 用了磁場和漩渦的原理，將液體放入容器中后；將攪拌子同時(shí)放入液體；當(dāng) 底座產(chǎn)生磁場后帶動(dòng)攪拌子成圓周循環(huán)運(yùn)動(dòng)，從而達(dá)到攪拌液體的目的。用途：當(dāng)?shù)味ü芤后w滴入反應(yīng)容器時(shí)會(huì)造成反應(yīng)液各處pH不均勻，磁力攪拌器將液體攪勻，便于下面 pH計(jì)的準(zhǔn)

12、確測定。d. 電泳裝置組成：電極、電源、電線等分類：自由電泳、區(qū)帶電泳原理：生物大分子如蛋白質(zhì)，核酸，多糖等大多都有陽離子和陰離子基團(tuán)，稱為兩性離子。常以顆粒分散在溶液中，它們的靜電荷取決于介質(zhì)的H+ 濃度或與其他大分子的相互作用.在電場中，帶電顆粒向陰極或陽極遷移， 遷移的方向取決于它們帶電的符號(hào)，這種遷移現(xiàn)象即所謂電泳。如果把生物 大分子的膠體溶液放在一個(gè)沒有干擾的電場中， 使顆粒具有恒定遷移速率的 驅(qū)動(dòng)力來自于顆粒上的有效電荷 Q和電位梯度E。用途：達(dá)到特定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度最低且不帶電荷，在外加電場作用下不會(huì)向兩極移動(dòng)；其它蛋白質(zhì)在特定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)不是它 們自己的等電點(diǎn)，

13、因此帶點(diǎn)，在外加電場下會(huì)移動(dòng)。用pH計(jì)精確控制分離緩沖液的pH,達(dá)到特定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，讓后自由電泳，將特定蛋白質(zhì)與其 它蛋白質(zhì)分離開來。e. 控制裝置名稱：pH計(jì)組成：一個(gè)參比電極；一個(gè)玻璃電極，其電位取決于周圍溶液的pH; 個(gè)電流計(jì)，該電流計(jì)能在電阻極大的電路中測量出微小的電位差。分類：1.按測量精度可分0.2級(jí)、0.1級(jí)、0.01級(jí)或更高精度。2. 按儀器體積分有筆式（迷你型）、便攜式、臺(tái)式還有在線連續(xù)監(jiān)控測 量的在線式。3. 根據(jù)使用的要求筆式（迷你型）與便攜式 PH酸堿度計(jì)一般是檢測人 員帶到現(xiàn)場檢測使用。原理：用電位法測定溶液的pH值是最基本的方法。電位測量pH的原理 來源于能斯特

14、公式。如把一支對(duì)氫離子可逆的電極和一支參比電極放人溶液 中，就組成了原電池。由于原電池中參比電極的電位在一定條件下是不變的， 那么原電池的電動(dòng)勢的數(shù)值就隨著被測溶液中氫離子的活度而變。因此，可 以通過測量原電池的電動(dòng)勢，計(jì)算溶液中的 pH值。操作過程：在帶有出口圓形玻璃器皿底部鋪上一層透析紙袋，將帶孔玻 璃板蓋在下部帶有出口圓形玻璃器皿上，（不易用方形玻璃器皿，因?yàn)閿嚢?時(shí)候易造成液體飛濺，容器內(nèi)已經(jīng)注有一定 pH的緩沖液），滴定管和電極電 線穿過玻璃板孔向容器內(nèi)滴加液滴（視情況滴加酸、堿、純水，液滴的量要 精確控制，以免pH受到較大波動(dòng)），在滴加液滴的同時(shí)打開磁力攪拌器緩慢 攪拌，使溶液各處

15、pH均勻，在此期間經(jīng)校正的pH計(jì)嚴(yán)格監(jiān)視溶液pH的變 化，隨液滴的滴加pH達(dá)到被分離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（之所以沒有提前加入被 分離蛋白質(zhì)樣品是避免pH波動(dòng)對(duì)被分離蛋白質(zhì)活性的影響），停止滴加液滴， 加入被分離蛋白質(zhì)樣品，再次測溶液pH并且調(diào)整溶液pH至被分離蛋白質(zhì)的 等電點(diǎn)。以上操作主要是為了找到被分離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，并沒有進(jìn)行電泳 操作，上述操作完成后，停止 pH計(jì)的測量，打開電泳操作進(jìn)行電泳，由于被分離蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)pH處不帶電，故而不移動(dòng)，其它帶點(diǎn)蛋白質(zhì)會(huì)在電 場作用下向相反電極移動(dòng)（控制電壓可以改變帶電蛋白質(zhì)的移動(dòng)速度），從而分離出目標(biāo)蛋白質(zhì)，然后通過下部帶有出口圓形玻璃器皿的出口取出被分

16、 離液，將透析紙袋取出，獲取目標(biāo)蛋白質(zhì)，將其儲(chǔ)存起來，關(guān)閉出口，再換 一張透析紙袋，將出口的分離液再次倒進(jìn)反應(yīng)裝置里，再次打開磁力攪拌器 緩慢攪拌，調(diào)整pH至剛分離的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，然后重復(fù)上述操作，進(jìn)一 步分離目標(biāo)蛋白質(zhì)，提高被分離蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。經(jīng)過上述操作已經(jīng)分離出所需目標(biāo)蛋白質(zhì)，分離完后。再次調(diào)整pH （高于剛分離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)），讓后再加入上述被分離蛋 白質(zhì)的樣品，重復(fù)上述操作，可用于分離比已經(jīng)分離出蛋白質(zhì)等電點(diǎn)高的所 需蛋白質(zhì)，逐次可分離出多種蛋白質(zhì)。完成蛋白質(zhì)的分離之后，清洗儀器（尤其是 pH計(jì)電極的清洗，必須嚴(yán) 格清理），風(fēng)干被清洗的器皿，以待下次再用。5.3蛋白質(zhì)的純度鑒定方法

17、：電泳，由于純的蛋白質(zhì)所帶電荷、相對(duì)分子量等都相同，所以純 的蛋白質(zhì)在一系列不同的pH條件下，都將以單一的速度移動(dòng)，它的電泳圖 譜只呈現(xiàn)一個(gè)條帶，因此據(jù)此可以判斷出蛋白質(zhì)的純度。N-末端分析也可用于鑒定純度，因?yàn)榫坏鞍踪|(zhì)的N-末端殘基只可能是 一種氨基酸。另外也有沉降、HPLC溶解度分析等方法，但無論任何單一一 種方法都只能作為蛋白質(zhì)均一性的必要條件而非充分條件。6. 參考文獻(xiàn)【1】孫彥.生物分離工程（第二版）.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.2【2】 陳國豪.生物工程設(shè)備.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009.5【3】劉葉青.生物分離工程實(shí)驗(yàn).北京：高等教育出版社，2007.8【4】 汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊.北京：科學(xué)出版社，2001【5】 譚天偉.生物分離技術(shù).北京：化學(xué)工業(yè)出版社，20077. 課程設(shè)計(jì)心得經(jīng)過幾周的努力設(shè)計(jì)，生物分離工程課程設(shè)計(jì)已經(jīng)順利