醫(yī)療器械無菌檢查(共61頁).ppt

1、1 醫(yī)療器械醫(yī)療器械- -無菌檢查無菌檢查 江蘇省醫(yī)療器械檢驗所江蘇省醫(yī)療器械檢驗所 2 主要內(nèi)容主要內(nèi)容n無菌定義及無菌檢查定義無菌定義及無菌檢查定義 n無菌檢驗依據(jù)無菌檢驗依據(jù)n試驗主要設(shè)備試驗主要設(shè)備n實驗環(huán)境條件及人員要求實驗環(huán)境條件及人員要求n培養(yǎng)基種類及配制要求培養(yǎng)基種類及配制要求n培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查n試驗菌種及菌液制備試驗菌種及菌液制備n無菌檢查方法驗證無菌檢查方法驗證n供試品無菌檢查及結(jié)果判斷供試品無菌檢查及結(jié)果判斷 3 無菌定義無菌定義: :無活微生物的狀態(tài)。無活微生物的狀態(tài)。無菌檢查定義無菌檢查定義 ： 無菌檢查法系用于檢查無菌檢查法系用于檢查藥典要求無菌的藥

2、品、原料、輔料及其藥典要求無菌的藥品、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。（1）無菌定義）無菌定義4 （2）無菌檢驗依據(jù)無菌檢驗依據(jù)本規(guī)范選用于本規(guī)范選用于中國藥典中國藥典20102010年版二年版二部附錄部附錄XI HXI H無菌檢查法。無菌檢查法。GB/T 14233.2-2005GB/T 14233.2-2005 醫(yī)用輸液、輸血、醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法注射器具檢驗方法 ，第二部分：生物，第二部分：生

3、物試驗方法中規(guī)定的無菌試驗方法。試驗方法中規(guī)定的無菌試驗方法。5 （3）試驗主要設(shè)備）試驗主要設(shè)備超凈工作臺超凈工作臺細(xì)菌培養(yǎng)箱細(xì)菌培養(yǎng)箱霉菌培養(yǎng)箱霉菌培養(yǎng)箱立式高壓蒸汽滅菌器立式高壓蒸汽滅菌器臺式高壓蒸汽滅菌器臺式高壓蒸汽滅菌器顯微鏡顯微鏡生物安全柜生物安全柜電熱恒溫干燥箱電熱恒溫干燥箱集菌儀集菌儀6試驗儀器（試驗儀器（1 1） - - 超凈工作臺超凈工作臺7試驗設(shè)備試驗設(shè)備（2）-隔水式恒溫培養(yǎng)箱隔水式恒溫培養(yǎng)箱8試驗設(shè)備（試驗設(shè)備（3 3）-霉菌培養(yǎng)箱霉菌培養(yǎng)箱9試驗設(shè)備試驗設(shè)備（4）-立式高壓蒸汽滅菌器立式高壓蒸汽滅菌器10試驗設(shè)備（試驗設(shè)備（5 5）-臺式蒸汽滅菌器臺式蒸汽滅菌器11

4、試驗設(shè)備（試驗設(shè)備（6 6）- 顯顯 微微 鏡鏡12試驗設(shè)備（試驗設(shè)備（7 7）- -生物安全柜生物安全柜13試驗設(shè)備（8）Equinox 全自動無菌檢驗系統(tǒng)14（4 4）實驗環(huán)境條件要求：）實驗環(huán)境條件要求： 無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10 00010 000級下的級下的局部潔凈度局部潔凈度100100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行，其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌離系統(tǒng)中進行，其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)、工操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室醫(yī)藥工業(yè)潔凈室( (區(qū)

5、區(qū)) )懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進行潔凈度驗證。隔離系統(tǒng)的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)進行潔凈度驗證。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈按相關(guān)的要求進行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。度須符合無菌檢查的要求。15 （4 4）實驗人員要求：實驗人員要求： 菌檢人員必須具備微生物專業(yè)知識，并菌檢人員必須具備微生物專業(yè)知識，并 經(jīng)過無菌技術(shù)培訓(xùn)。經(jīng)過無菌技術(shù)培訓(xùn)。 16（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基種類及要求種類及要求 n硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基n改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基2012年12月1717（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基

6、種類及要求種類及要求 n無菌檢查：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基無菌檢查：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基2012年12月1818（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基種類及要求種類及要求 無菌檢查無菌檢查 ：改良馬丁培養(yǎng)基：改良馬丁培養(yǎng)基：19（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基種類及要求種類及要求 保存時間：保存時間： 制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在：制備好的培養(yǎng)基應(yīng)保存在：2 2 2525、避光避光 n 非密閉容器中：一般在三周內(nèi)使用非密閉容器中：一般在三周內(nèi)使用n 密閉容器中：一般可在一年內(nèi)使用密閉容器中：一般可在一年內(nèi)使用20（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基種類及要求種類及要求 一般采用商品脫水培養(yǎng)基一般采用商品脫水培養(yǎng)基，臨用時按照臨用時按照使

7、用說明書進行配制，配制時須迅速，使用說明書進行配制，配制時須迅速，以免吸潮影響稱量的準(zhǔn)確性，同時需注以免吸潮影響稱量的準(zhǔn)確性，同時需注意滅菌后培養(yǎng)基的意滅菌后培養(yǎng)基的pHpH值值應(yīng)符合規(guī)定，否應(yīng)符合規(guī)定，否則必須校正后滅菌使用。則必須校正后滅菌使用。新鮮配制的培養(yǎng)基，應(yīng)符合新鮮配制的培養(yǎng)基，應(yīng)符合中國藥典中國藥典規(guī)定的配方，對培養(yǎng)基進行挑選。規(guī)定的配方，對培養(yǎng)基進行挑選。21（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基種類及要求種類及要求 硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基：屬于流體培養(yǎng)基，屬于流體培養(yǎng)基，即在液體培養(yǎng)基中加入即在液體培養(yǎng)基中加入0.05%0.05%0.07%0.07%的的瓊脂瓊脂，增加了培養(yǎng)基的

8、粘度，降低培養(yǎng)，增加了培養(yǎng)基的粘度，降低培養(yǎng)基中的含氧量，使培養(yǎng)基在一段時間內(nèi)基中的含氧量，使培養(yǎng)基在一段時間內(nèi)保持厭氧的條件，有利于厭氧菌的生長。保持厭氧的條件，有利于厭氧菌的生長。硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基分裝在適宜的容器中，硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基分裝在適宜的容器中，其粉紅色的其粉紅色的氧化層氧化層適合需氣菌的生長，適合需氣菌的生長，在供試品接種前，培養(yǎng)基的氧化層的顏在供試品接種前，培養(yǎng)基的氧化層的顏色不得超過培養(yǎng)基深度的色不得超過培養(yǎng)基深度的1 15 5，調(diào)，調(diào)PHPH值值滅菌后為滅菌后為7.17.10.20.2，分裝，滅菌。，分裝，滅菌。硫乙醇酸鹽培養(yǎng)管置：硫乙醇酸鹽培養(yǎng)管置：30303535培養(yǎng)培養(yǎng)

9、1414天。天。22（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基種類及要求種類及要求 n改良馬丁培養(yǎng)基：改良馬丁培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基成分混合，微取培養(yǎng)基成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)溫溶解，調(diào)節(jié)PHPH值約為值約為6.86.8，煮沸，搖勻，煮沸，搖勻，調(diào)調(diào)PHPH值滅菌后為值滅菌后為6.46.40.20.2，分裝，滅菌。，分裝，滅菌。n 改良馬丁培養(yǎng)基：改良馬丁培養(yǎng)基：置置23232828培養(yǎng)培養(yǎng)1414天。天。23（5 5）培養(yǎng)基）培養(yǎng)基種類及要求種類及要求 培養(yǎng)基裝量培養(yǎng)基裝量：n對于采用直接接種法檢查的對于采用直接接種法檢查的液體液體樣品，培樣品，培養(yǎng)基的裝量與供試品裝量相關(guān)，應(yīng)根據(jù)供養(yǎng)基的裝量與供試品裝量相關(guān)，應(yīng)根

10、據(jù)供試品接種量確定培養(yǎng)基的裝量，使供試品試品接種量確定培養(yǎng)基的裝量，使供試品接種體積不大于培養(yǎng)基的接種體積不大于培養(yǎng)基的10%10%。n對于采用直接接種法檢查的對于采用直接接種法檢查的固體固體樣品，培樣品，培養(yǎng)基的裝量均為養(yǎng)基的裝量均為100ml100ml；一次性醫(yī)用材料；一次性醫(yī)用材料及醫(yī)療器具，若醫(yī)療器具體積過大，培養(yǎng)及醫(yī)療器具，若醫(yī)療器具體積過大，培養(yǎng)基的裝量可基的裝量可2000ml2000ml以上，已將其完全浸沒以上，已將其完全浸沒為準(zhǔn)。為準(zhǔn)。n對于采用對于采用薄膜過濾法薄膜過濾法檢查的樣品，封閉式檢查的樣品，封閉式薄膜濾器的培養(yǎng)基裝量為薄膜濾器的培養(yǎng)基裝量為100ml 100ml 。

11、24 （6）培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查n新購的培養(yǎng)基或自配的新鮮培養(yǎng)基要求：新購的培養(yǎng)基或自配的新鮮培養(yǎng)基要求：n無菌性檢查：無菌性檢查：n每批培養(yǎng)基隨機取不少于每批培養(yǎng)基隨機取不少于5 5支（瓶），培養(yǎng)支（瓶），培養(yǎng)1414天，天，應(yīng)無菌生長。應(yīng)無菌生長。n靈敏度檢查：靈敏度檢查：n其質(zhì)量均應(yīng)符合其質(zhì)量均應(yīng)符合靈敏度檢查要求靈敏度檢查要求。用于培養(yǎng)基靈敏。用于培養(yǎng)基靈敏度檢查的菌種如下：菌種的傳代的次數(shù)不得超過度檢查的菌種如下：菌種的傳代的次數(shù)不得超過5 5代代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 0代代）。）。25（6）培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用

12、性檢查菌種：試驗用菌株及菌液制備：菌種：試驗用菌株及菌液制備：n金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003CMCC(B)26003n銅綠色假單胞菌銅綠色假單胞菌CMCC(B)10104 CMCC(B)10104 n大腸埃希菌大腸埃希菌CMCC(B)44102CMCC(B)44102n枯草桿菌枯草桿菌CMCC(B)63501 CMCC(B)63501 n生孢梭菌生孢梭菌CMCC(B)64941 CMCC(B)64941 n白色念珠菌白色念珠菌CMCC(F)98001 CMCC(F)98001 n黑曲霉黑曲霉CMCC(F)98003 CMCC(F)98003 菌種的要求：菌種的要求： 不

13、得超過不得超過5 5代。采用適代。采用適宜的方法保存；并以保證試驗菌宜的方法保存；并以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。株的生物學(xué)特性。 26（6）培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查 菌液制備菌液制備 n一般當(dāng)日使用。一般當(dāng)日使用。n取取金黃金黃色葡萄球菌、色葡萄球菌、銅綠銅綠假單胞菌、假單胞菌、枯草枯草芽孢桿菌，少許接芽孢桿菌，少許接種至營養(yǎng)肉湯基中，種至營養(yǎng)肉湯基中，生孢生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30303535培養(yǎng)培養(yǎng)18 18 24h24h；n白色白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種改良馬丁培養(yǎng)基中，念珠菌的新鮮培養(yǎng)物接種改良馬

14、丁培養(yǎng)基中， 23232828培養(yǎng)培養(yǎng)24 24 48h48h，上述培養(yǎng)物用，上述培養(yǎng)物用0.9%0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌無菌氯化鈉溶液制成含菌量小于量小于100cfu/ml100cfu/ml菌懸液；菌懸液；n黑曲黑曲霉霉 菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基菌斜面的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，上， 23232828培養(yǎng)培養(yǎng)5 5 7 7天，使大量的孢子成熟。加入天，使大量的孢子成熟。加入3 3 5ml5ml含含0.05%0.05%（ml/mlml/ml）聚山梨酯）聚山梨酯8080的的0.9%0.9%無菌氯化鈉溶液，將無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后用適宜的方法吸

15、出孢子懸液至無菌試管中，孢子洗脫。然后用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管中，用含用含0.05%0.05%（ml/mlml/ml）聚山梨酯）聚山梨酯8080的的0.9%0.9%無菌氯化鈉溶液制成無菌氯化鈉溶液制成小于小于100cfu/ml 100cfu/ml 的孢子懸液。（見表）的孢子懸液。（見表）27 （6）培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查 中國藥典中國藥典20102010年無菌檢查驗證試驗中使用年無菌檢查驗證試驗中使用7 7株菌見下表株菌見下表菌菌 種種 接種培養(yǎng)基接種培養(yǎng)基 培養(yǎng)溫度培養(yǎng)溫度 培養(yǎng)時間培養(yǎng)時間金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 營養(yǎng)肉湯或者普通營養(yǎng)肉湯或者普通斜面斜面 30303

16、535 181824h24h銅綠假單孢菌銅綠假單孢菌 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌 大腸埃希菌大腸埃希菌 （無）（無）生孢梭菌生孢梭菌硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基白色念珠菌白色念珠菌 改良馬丁或者普通改良馬丁或者普通斜面斜面 23232828 242448h48h黑曲霉黑曲霉 改良馬丁斜面改良馬丁斜面 232328285 57d 7d 28（6）培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查 培養(yǎng)基接種培養(yǎng)基接種 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌2 2支支 銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌2 2支支硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌2 2支支 生孢梭菌生孢梭菌2 2支支 9 9支培養(yǎng)基裝

17、量支培養(yǎng)基裝量12ml12ml，空白對照空白對照1 1支。支。 分別接種小于分別接種小于100cfu/ml100cfu/ml金葡、銅綠、枯草、生孢金葡、銅綠、枯草、生孢各各2 2管管，另，另1 1支不接種做空白對照，支不接種做空白對照，培養(yǎng)培養(yǎng)3 3天，逐日觀察天，逐日觀察結(jié)果。結(jié)果。29（5）培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查 培養(yǎng)基接種培養(yǎng)基接種 白色念株菌白色念株菌2 2支支改良馬丁培養(yǎng)改良馬丁培養(yǎng) 黑曲霉黑曲霉2 2支支 （5 5支培養(yǎng)基裝量支培養(yǎng)基裝量9ml9ml，其中，其中1 1支做空白對照）支做空白對照） 分別接種小于分別接種小于100cfu/ml100cfu/ml白色、黑曲各兩支

18、白色、黑曲各兩支，另另1 1支不接種做空白對照。支不接種做空白對照。培養(yǎng)培養(yǎng)5 5天，逐日觀察結(jié)天，逐日觀察結(jié)果。果。30（6）培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果判斷結(jié)果判斷 空白對照管應(yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)管均生空白對照管應(yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。31（7）試驗）試驗(驗證驗證)菌種及菌液制備菌種及菌液制備菌種：試驗用菌株及菌液制備：菌種：試驗用菌株及菌液制備：n金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003CMCC(B)26003n大腸埃希菌大腸埃希菌CMCC(B)44102CMCC(B)4410

19、2n枯草桿菌枯草桿菌CMCC(B)63501 CMCC(B)63501 n生孢梭菌生孢梭菌CMCC(B)64941 CMCC(B)64941 n白色念珠菌白色念珠菌CMCC(F)98001 CMCC(F)98001 黑曲霉黑曲霉CMCC(F)98003 CMCC(F)98003 32（6）試驗菌種及菌液制備）試驗菌種及菌液制備n1010倍梯度稀釋倍梯度稀釋n選擇適宜的選擇適宜的3 3個稀釋級別個稀釋級別n要求要求100cfu/ml100cfu/ml33（7）無菌檢查方法驗證）無菌檢查方法驗證n驗證準(zhǔn)備條件：驗證準(zhǔn)備條件： n 稀釋液、沖洗液及其制備方法稀釋液、沖洗液及其制備方法n 0.10.1

20、蛋白胨水溶液蛋白胨水溶液n pH7.0pH7.0氯化鈉氯化鈉蛋白胨緩沖液蛋白胨緩沖液1.1. 制備的菌液，應(yīng)當(dāng)日使用。制備的菌液，應(yīng)當(dāng)日使用。34（7）無菌檢查方法驗證）無菌檢查方法驗證 目的目的: :n證明所采用的方法適合于該供試品的無菌檢查證明所采用的方法適合于該供試品的無菌檢查n確認(rèn)供試品在該實驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性確認(rèn)供試品在該實驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計?？梢院雎圆挥?。1.1.確保在實際檢驗條件下，該供試品的無菌檢查法的準(zhǔn)確保在實際檢驗條件下，該供試品的無菌檢查法的準(zhǔn)確性、有效性和重現(xiàn)性。確性、有效性和重現(xiàn)性。 驗證時，按驗證時，按“供試品的無供試品的無菌檢查

21、菌檢查”的規(guī)定及下列要求進行操作。對每一試驗菌的規(guī)定及下列要求進行操作。對每一試驗菌應(yīng)逐一進行驗證。應(yīng)逐一進行驗證。35（7）無菌檢查方法驗證）無菌檢查方法驗證菌種及菌液制備菌種及菌液制備 ：除大腸埃希菌除大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC(B) 4 4102外，外，金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 、 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌 、 生孢梭生孢梭菌、菌、 白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。 方法驗證試驗與靈敏度檢驗所有菌種區(qū)別：方法驗證試驗與靈敏度檢驗所有菌種區(qū)

22、別：大大腸埃希菌代替腸埃希菌代替銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌。36（7）無菌檢查方法驗證）無菌檢查方法驗證n菌液制備：菌液制備： n金黃色葡萄球菌（大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌金黃色葡萄球菌（大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌) ) 接種營接種營養(yǎng)肉湯（或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）養(yǎng)肉湯（或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）n生孢梭菌接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基生孢梭菌接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 30303535培養(yǎng)培養(yǎng)18182424小時；小時；n白色念珠菌接種改良馬丁培養(yǎng)基（或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)白色念珠菌接種改良馬丁培養(yǎng)基（或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基）基）23232828培養(yǎng)培養(yǎng)24244848小時小時n上述培養(yǎng)物上述培養(yǎng)物 用用0.90.9無菌

23、氯化鈉溶液制成每無菌氯化鈉溶液制成每1ml1ml含菌數(shù)小含菌數(shù)小于于l00cfu(l00cfu(菌落形成單位菌落形成單位) )的菌懸液。的菌懸液。n 黑曲霉接種改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，黑曲霉接種改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23232828培養(yǎng)培養(yǎng)5 57 7天，加入天，加入3 35ml 0.95ml 0.9無菌氯化鈉溶液，將孢子洗無菌氯化鈉溶液，將孢子洗 吸出孢子懸液吸出孢子懸液( (用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌用管口帶有薄的無菌棉花或紗布能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管絲的無菌毛細(xì)吸管) )至無菌試管內(nèi)用至無菌試管內(nèi)用0.90.9無菌氯化鈉溶無菌氯化鈉溶液制成每液制成每lmllml含孢子數(shù)小

24、于含孢子數(shù)小于l00cful00cfu的孢子懸液。的孢子懸液。37（7）無菌檢查方法驗證）無菌檢查方法驗證n薄膜過濾法薄膜過濾法n將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入試驗菌（小于在最后一次的沖洗液中加入試驗菌（小于100cfu100cfu），過濾。取出濾膜接種至相應(yīng)的培養(yǎng)），過濾。取出濾膜接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一濾桶，基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一濾桶，不過濾供試品，其它操作同上，作為對照不過濾供試品，其它操作同上，作為對照. .將將含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定溫度培養(yǎng)含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定溫度培養(yǎng)3 35

25、 5天。天。 各各試驗菌及相應(yīng)的培養(yǎng)基逐一進行驗證。試驗菌及相應(yīng)的培養(yǎng)基逐一進行驗證。n（如下圖示）（如下圖示）38（7）無菌檢查方法驗證）無菌檢查方法驗證薄膜過濾法薄膜過濾法 規(guī)定量的供試品規(guī)定量的供試品 過濾過濾 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 濾膜濾膜 接種接種 改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基沖洗沖洗 每種菌均作每種菌均作1 1管不含供試品管作為對照管不含供試品管作為對照加入試驗菌加入試驗菌過濾過濾39（7）無菌檢查方法驗證）無菌檢查方法驗證n 直接接種法直接接種法 n 取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基酸鹽流體培養(yǎng)基8 8

26、管，分別接人小于管，分別接人小于l00cful00cfu的的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各菌、生孢梭菌各2 2管；取符合直接接種法培養(yǎng)管；取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4 4管，分別接入管，分別接入小于小于l00cful00cfu的白色念珠菌、黑曲霉各的白色念珠菌、黑曲霉各2 2管。其管。其中中1 1管接人規(guī)定量的供試品，另管接人規(guī)定量的供試品，另1 1管作為對照，管作為對照，按規(guī)定的溫度培養(yǎng)按規(guī)定的溫度培養(yǎng)3 35 5天。（如下表）天。（如下表）40（7）無菌檢查方法驗證）無菌檢查方法驗

27、證-直接接種法直接接種法方法驗證所用菌種（藥典方法驗證所用菌種（藥典2010版規(guī)定）版規(guī)定）金黃色葡萄球金黃色葡萄球菌菌分別接種各菌分別接種各菌種新鮮培養(yǎng)物種新鮮培養(yǎng)物至相應(yīng)培養(yǎng)基至相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將培中培養(yǎng)，將培養(yǎng)物用養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶無菌氯化鈉溶液制成菌懸液，液制成菌懸液，濃度小濃度小100cfu/mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8支：支：分分別接種小于別接種小于100cfu的金葡、大的金葡、大腸、枯草、生孢各腸、枯草、生孢各2支，其中支，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另接種量，另1管作為對照，培養(yǎng)管作為對照，培養(yǎng)3天。天。大腸

28、埃希菌大腸埃希菌枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌生孢梭菌白色念珠菌白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基4支支：分別接種：分別接種小于小于100cfu的白念、黑曲霉各的白念、黑曲霉各2支，其中支，其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另定的供試品接種量，另1管作為管作為對照，培養(yǎng)對照，培養(yǎng)5天。天。黑曲霉黑曲霉41（7）無菌檢查方法驗證）無菌檢查方法驗證n結(jié)果判斷 n與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下生長良好，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此

29、檢無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查法和檢驗條件進行供試品的無菌檢查。如含供查法和檢驗條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌長，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用?？刹捎茫鹤饔??？刹捎茫?)1)增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基的用量；增加沖洗量，或增加培養(yǎng)基的用量；2)2)使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法驗證。除供試品的抑菌作用，并重新進行方法驗證。42（8）供試品無菌檢查）供試品

30、無菌檢查n在在100100級超凈臺內(nèi)，應(yīng)在酒精燈火焰周圍，以無菌操級超凈臺內(nèi)，應(yīng)在酒精燈火焰周圍，以無菌操作法將規(guī)定量的供試品分別接種至含硫乙醇酸鹽流體作法將規(guī)定量的供試品分別接種至含硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（不少于培養(yǎng)基（不少于15ml/15ml/管）和改良馬丁培養(yǎng)基（不少管）和改良馬丁培養(yǎng)基（不少于于10ml/10ml/管）的容器中。管）的容器中。n注意事項：注意事項：n嚴(yán)格遵守?zé)o菌技術(shù)操作，切勿人為造成污染；嚴(yán)格遵守?zé)o菌技術(shù)操作，切勿人為造成污染；1.1.試驗器具溫度不可過高以免將可能存在的菌燙死試驗器具溫度不可過高以免將可能存在的菌燙死。43（8）供試品無菌檢查）供試品無菌檢查供試品包裝須

31、完好無損，尤其是只有一層包裝供試品包裝須完好無損，尤其是只有一層包裝的樣品。的樣品。供試品若有兩層（或兩層以上）包裝的，進入供試品若有兩層（或兩層以上）包裝的，進入無菌檢驗室需將外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆無菌檢驗室需將外包裝在傳遞窗（或緩沖間）拆除后，傳入實驗室。除后，傳入實驗室。開啟潔凈區(qū)紫外燈和空氣過濾裝置并其工作開啟潔凈區(qū)紫外燈和空氣過濾裝置并其工作1 1小小時以上。時以上。 操作人員準(zhǔn)備：帶口罩、帽子、穿專用無菌服、操作人員準(zhǔn)備：帶口罩、帽子、穿專用無菌服、鞋進入無菌室。鞋進入無菌室。每次試驗中所用物品必須計劃好，并有備用每次試驗中所用物品必須計劃好，并有備用44（8）供試品無菌檢查

32、）供試品無菌檢查無菌檢查法包括：無菌檢查法包括：薄膜過濾法和直接接種法。薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法。進行供試品無菌檢查時，過濾法。進行供試品無菌檢查時，所采用的檢驗方法和檢驗條件應(yīng)與所采用的檢驗方法和檢驗條件應(yīng)與驗證的方法相同。驗證的方法相同。 45（8）供試品無菌檢查）供試品無菌檢查細(xì)菌檢測管：細(xì)菌檢測管：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基+ +供試品供試品真菌檢測管：真菌檢測管：改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基+ +供試品供試品陽性對照管：陽性對照管：對應(yīng)陽性菌對應(yīng)陽性菌+ +對應(yīng)培養(yǎng)基對應(yīng)培養(yǎng)基+ +供試品供試品陰性對照管

33、：陰性對照管：應(yīng)取相應(yīng)的溶劑和稀釋液或沖洗液應(yīng)取相應(yīng)的溶劑和稀釋液或沖洗液 + +培養(yǎng)基培養(yǎng)基 46（8）供試品無菌檢查）供試品無菌檢查 檢驗數(shù)量：檢驗數(shù)量：n 是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。n 一般情況下，供試品無菌檢查若采用一般情況下，供試品無菌檢查若采用薄膜過濾薄膜過濾法法，應(yīng)增加最小檢驗數(shù)量的，應(yīng)增加最小檢驗數(shù)量的1/21/2作陽性對照用；若作陽性對照用；若采用直接接種法，應(yīng)增加供試品無菌檢查時每個采用直接接種法，應(yīng)增加供試品無菌檢查時每個培養(yǎng)基容器接種的樣品量做陽性對照用。培養(yǎng)基容器接種的樣品量做陽性對照用。 47（8）供試品無菌

34、檢查）供試品無菌檢查檢驗量：檢驗量：是指一次試驗所用的供試品總量（是指一次試驗所用的供試品總量（g g或或mlml）。）。采用直接接種法時：采用直接接種法時：若每支（瓶）供試品的裝量按若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時：采用薄膜過濾法時：檢驗量應(yīng)不少于直接接種法的檢驗量應(yīng)不少于直接接種法的供試品總接種量，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有供試品總接種量，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾。 48（8）供試品

35、無菌檢查）供試品無菌檢查 直接接種法：直接接種法： 每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的1010，同時硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少同時硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于于15ml15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml10ml。培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗證試。培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗證試驗；每種培養(yǎng)基接種的管數(shù)同供試品的檢驗；每種培養(yǎng)基接種的管數(shù)同供試品的檢驗數(shù)量。驗數(shù)量。4949（8）供試品無菌檢查）供試品無菌檢查 n陰性對照：陰性對照：供試品無菌檢查時，應(yīng)取

36、相應(yīng)溶劑和供試品無菌檢查時，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得稀釋液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。有菌生長。 n陰性對照：陰性對照：目的是驗證相應(yīng)溶劑和稀釋液本身是目的是驗證相應(yīng)溶劑和稀釋液本身是否存在污染，防止假陽性。否存在污染，防止假陽性。5050（8）供試品無菌檢查）供試品無菌檢查陽性對照陽性對照：應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌；無抑應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌；無抑菌作用供試品以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌。陽性菌作用供試品以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同方法驗證試驗，加菌量小于對照試驗的菌液制備同方法驗證試驗，加菌量小于10

37、0cfu/ml100cfu/ml，供試品用量同供試品無菌檢查每份接種，供試品用量同供試品無菌檢查每份接種量相同。陽性對照管培養(yǎng)量相同。陽性對照管培養(yǎng)48 48 72 72小時應(yīng)生長良好。小時應(yīng)生長良好。陽性對照：陽性對照：目的是驗證試驗結(jié)果可靠性，防止假陰性。目的是驗證試驗結(jié)果可靠性，防止假陰性。5151（8）供試品無菌檢查）供試品無菌檢查 薄膜過濾法：薄膜過濾法：n20102010年版年版中國藥典中國藥典規(guī)定規(guī)定: :只要供試品性狀允許，只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查應(yīng)采用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應(yīng)與驗證的方法相同。方法和檢驗條件

38、應(yīng)與驗證的方法相同。n在蠕動泵的作用下，被測產(chǎn)品通過裝有帶空氣過濾在蠕動泵的作用下，被測產(chǎn)品通過裝有帶空氣過濾器的針頭及無菌管路直接從樣品容器中進入濾筒中，器的針頭及無菌管路直接從樣品容器中進入濾筒中，免去了通常膜轉(zhuǎn)移過程中易產(chǎn)生的污染。免去了通常膜轉(zhuǎn)移過程中易產(chǎn)生的污染。n無菌檢查法中薄膜過濾法所用的濾膜孔徑應(yīng)不大于無菌檢查法中薄膜過濾法所用的濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45m0.45m，直徑約為，直徑約為50mm50mm。5252（8）供試品無菌檢查）供試品無菌檢查水溶液供試品水溶液供試品取規(guī)定量的供試液，直接過濾，或混合至適量稀釋液的無菌容器內(nèi)，混勻，立即過濾。取規(guī)定量的供試液，直接過濾，或混合至適量稀釋液的無菌容