單細(xì)胞多重巢式PCR在多囊腎病中胚胎植入前診斷的實(shí)驗(yàn)研究

1、單細(xì)胞多重巢式PCR在多囊腎病中胚胎植入前診斷的實(shí)驗(yàn)研究                             作者：朱琴 徐炳森 黃學(xué)鋒 周穎【摘要】  目的 建立單細(xì)胞的多重巢式熒光PCR技術(shù)，為開展常染色體顯性多囊腎疾病行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷提供依據(jù)。方法 用四重?zé)晒獬彩絇CR和毛細(xì)管電泳對單個淋巴細(xì)

2、胞的KG8、SM6、CW4和CW2四個微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果 單個淋巴細(xì)胞KG8、SM6、CW4和CW2擴(kuò)增成功率分別為85.93（55/64）、89.06%（57/64）、92.18%(59/64)和89.06%（57/64），KG8、CW4和CW2的等位基因脫扣率分別為25.64%（10/39）、25（4/16）和7.01%（4/57），兩個位點(diǎn)同時發(fā)生的ADO率為2.56%（1/39）。結(jié)論 該方法為常染色體顯性多囊腎疾病行胚胎植入前遺傳學(xué)診斷提供了依據(jù)。 【關(guān)鍵詞】  微衛(wèi)星 多囊腎 胚胎植入前遺傳學(xué)診斷【Abstract】  Objective 

3、 To establish the technology of multiple nest fluorescence single cell PCR, for preimplantation genetic diagnosis for autosomal dominant polycystic kidney disease. Method  Use quadruplex nested fluorescent PCR and capillary electrophoresis to analysis the polymorphism type of KG8, SM6, CW4 and

4、CW2 of single lymphocytes. Result  The amplification success rate of KG8, SM6, CW4 and CW2 are 85.93%, 89.06%, 92.18% and 89.06%, respectively, and the ADO of KG8, CW4 and CW2 are 25.64%, 25% and 7.01%, While the ADO is 2.56% in two microsatellites discovered simultaneous. Conclusion  It p

5、rovide an evidence of using this technique for the PGD for ADPKD.    【Key words】  Microsatellite  ADPKD  Preimplantation genetic diagnosis    常染色體顯性多囊腎疾病（autosomal dominant polycystic kidney disease, ADPKD）是最常見的常染色體顯性遺傳的單基因遺傳病，人群發(fā)病率為1/10001。ADPKD的主要表現(xiàn)為腎臟進(jìn)

6、行性囊性改變，常導(dǎo)致終末期腎病，居我國終末期腎病病因的第4位2。除了腎臟病變外，還累及全身多個器官，如肝囊腫、高血壓、顱內(nèi)動脈瘤、心瓣膜畸形等，是一全身性疾病。而且ADPKD具有延遲性發(fā)病的特點(diǎn)，其癥狀發(fā)生前檢查結(jié)果很少能影響未生育患者的生育意向，使其成為最易遺傳給下一代的嚴(yán)重遺傳病之一。因此，對ADPKD患者進(jìn)行PGD既可滿足患者生育的愿望，又可避免生育患有ADPKD的后代。目前認(rèn)為，ADPKD主要與PKD1和PKD2基因有關(guān)，PKD1突變引起的ADPKD占80%853，4，PKD2基因突變引起的ADPKD占10%15%5，這兩個基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，缺乏突變熱點(diǎn)，因此難以通過直接檢測突變行PGD診

7、斷。本研究擬利用與PKD1緊密連鎖的KG8、SM6、CW4和CW2四個微衛(wèi)星位點(diǎn)，行四重巢式熒光PCR和毛細(xì)管電泳，為ADPKD的PGD研究提供診斷依據(jù)。    1  材料與方法    1.1  實(shí)驗(yàn)材料  任取2位來本中心就診患者的淋巴細(xì)胞64個，其中A患者獲取18個，B患者46個。取材均得到患者的同意。    1.2  實(shí)驗(yàn)方法  （1）單個淋巴細(xì)胞制備：先用percoll 60分離出單個核細(xì)胞，然后在倒置顯微鏡下通過顯微操作吸取單個淋巴細(xì)胞，分別在3

8、滴PBS液中洗滌，同時取最后1個微滴洗滌后液體為陰性對照，將單個淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移于含5l細(xì)胞裂解液的PCR管中，20保存?zhèn)溆谩＃?）PCR反應(yīng)：KG8、CW4和CW2的內(nèi)引物6，其余引物均由primer 3軟件自動生成。內(nèi)引物中正引物均有FAM熒光標(biāo)記。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，具體內(nèi)外引物序列見表1。第一輪PCR：64個淋巴細(xì)胞均應(yīng)用四重巢式PCR，同時擴(kuò)增微衛(wèi)星KG8、SM6、CW4、CW2，反應(yīng)體系均為50l，其中模板含5l細(xì)胞裂解液的單個卵裂球，10×PCR buffer 4.5l，dNTP 3l（10mmol/L），鎂離子4.5l（50mmol/L），KG8和

9、CW2正反引物各加2l（10mol/L），SM6和CW4引物各加3l（10umol/L），High Fidelity Taq酶0.3l，用水補(bǔ)充至50l。先滅活蛋白酶K，45 1min，96 20min，然后在72時將上述反應(yīng)液加入到模板里，96 1min，96 30s，58 1.5min，72 1min，共25個循環(huán)，最后72再延伸10min。10 PCR buffer、dNTP、鎂離子和酶均由invitrogen公司。第二輪PCR：反應(yīng)體系均為10l，KG8反應(yīng)體系為10×PCR buffer1l，10mM的dNTP 0.5l，5mM鎂離子1.4l，10M的KG8正反引物各0.4

10、l，模板1l，High Fidelity Taq酶0.07l，最后用水補(bǔ)充至10l；PCR循環(huán)條件96 4min,96 45s,58 45s，72 30s，共36個循環(huán),最后72再延伸10min。SM6、CW4、CW2、鎂離子濃度依次為0.9mmol/L、1.1mmol/L、0.9mmol/L，退火溫度依次為60、60、55，其余條件都等同于KG8。（3）電泳：擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)預(yù)期條帶的樣品繼續(xù)擴(kuò)增45l進(jìn)行毛細(xì)管電泳，做STR（short tandem repeats，STR）分型（由上海基康公司和上海聯(lián)合基因提供服務(wù)）。 表1  四個微衛(wèi)星位點(diǎn)的內(nèi)外引物序

11、列    2  結(jié)果    2.1  CW4、CW2、KG8微衛(wèi)星位點(diǎn)信息  A患者CW4和CW2位點(diǎn)有多態(tài)性信息，B患者KG8和CW2位點(diǎn)有多態(tài)性信息。    2.2  單個淋巴細(xì)胞擴(kuò)增成功率  64個淋巴細(xì)胞有59個擴(kuò)增成功，擴(kuò)增成功率為92.18%，其中KG8擴(kuò)增成功率為85.93（55/64），SM6擴(kuò)增成功率為89.06%（57/64），CW4擴(kuò)增成功率為92.18%(59/64)，CW2擴(kuò)增成功率為89.06%（57/64）。 

12、60;  2.3  等位基因脫扣率  KG8的等位基因脫扣率為25.64%（10/39），CW4的等位基因脫扣率為25（4/16），CW2的等位基因脫扣率為7.01%（4/57），在B患者中有1個淋巴細(xì)胞的兩個位點(diǎn)同時發(fā)生ADO，發(fā)生率為2.56%（1/39）。    2.4  陰性對照  陰性對照未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。    3  討論    ADPKD是一全身性疾病，目前尚無特異的措施，只是一些對癥治療和延緩多囊腎病向ESRD進(jìn)展的干預(yù)措施，多數(shù)患

13、者最終將到終末期腎衰而不得不進(jìn)行腎臟替代治療和腎移植手術(shù)。為此，有必要對有ADPKD發(fā)病傾向的家庭成員，進(jìn)行癥狀前診斷，以改變其生活方式，遠(yuǎn)離高危致病因素，達(dá)到延緩和防止該病的發(fā)生。1             伴隨著輔助生殖技術(shù)日益成熟的今天，PGD越來越受到世人的關(guān)注，對配子或著床前的胚胎進(jìn)行遺傳物質(zhì)分析，選擇沒有遺傳物質(zhì)異常的胚胎移植，既能防止患兒的出生，又能避免流產(chǎn)、引產(chǎn)給夫婦雙方帶來的生理和心理上創(chuàng)傷。自1990年誕生了世界第一例經(jīng)PGD的健康女嬰以來7，世界上已經(jīng)進(jìn)行了600

14、0多個PGD周期、至少1000個左右的經(jīng)PGD診斷后的正常孩子出生8。但是由于ADPKD的致病基因龐大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有較多的重復(fù)序列、突變可能涉及整個基因，種類多并缺乏突變熱點(diǎn)，因此目前ADPKD常用的遺傳學(xué)診斷方法是采用對與致病基因緊密連鎖的微衛(wèi)星進(jìn)行連鎖分析。本研究應(yīng)用的與PKD1連鎖的KG8、SM6、CW4和CW2在人群中是高度多態(tài)的6。2004年Verlinskey等9、2005年Rycke等10均利用微衛(wèi)星為連鎖標(biāo)記，相繼在ADPKD的PGD上獲得成功。    PGD主要診斷材料來源是卵裂球細(xì)胞，活檢卵裂球既要保證檢測結(jié)果正確，又不能影響胚胎的發(fā)育，這才是

15、最佳的診斷方法。在單基因疾病的PGD中主要采用的方法是PCR，加上每次的PGD只能選取12個卵裂球，在模板量極其有限的情況下，PCR擴(kuò)增失敗、污染、等位基因脫扣等都將導(dǎo)致診斷錯誤或者根本無法得到診斷結(jié)果。本研究多重PCR的擴(kuò)增成功率高達(dá)92.18%，研究中應(yīng)用的單個淋巴細(xì)胞的清洗、轉(zhuǎn)移均在顯微鏡下操作，確保淋巴細(xì)胞放入到PCR管中用蛋白酶K裂解細(xì)胞，確保細(xì)胞裂解充分。本研究中四重PCR中，四個微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增成功率也不同，原因可能為DNA部分降解或者裂解不充分。    單細(xì)胞PCR存在另一個問題是可能發(fā)生ADO，即2條等位基因只擴(kuò)增出1條，是導(dǎo)致PGD誤診的另一重

16、要原因。引起ADO的確切原因尚未知曉，Piyamongkol等11研究表明ADO可能與擴(kuò)增片段的長度、DNA降解數(shù)量、細(xì)胞的凍融、PCR程序、同時擴(kuò)增的單細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，與局部DNA序列、變性溫度和細(xì)胞類型無關(guān)，即使在最有經(jīng)驗(yàn)的PGD實(shí)驗(yàn)室的ADO率也達(dá)5%15。本研究采用多重PCR、熒光PCR及同時檢測多個微衛(wèi)星位點(diǎn)可降低由于ADO導(dǎo)致的誤診。本研究中KG8、CW4和CW2的等位基因脫扣率分別為25.64%、25、7.01%，在B患者中有1個淋巴細(xì)胞的兩個位點(diǎn)同時發(fā)生ADO，發(fā)生率為2.56%（1/39），與Rechitsky等12在囊性纖維化（CF）的PGD診斷中報(bào)道一致，因此多重PCR同時

17、擴(kuò)增多個微衛(wèi)星位點(diǎn)可以減少由于ADO而導(dǎo)致的PGD誤診率。Wirawit等11報(bào)道同時用兩個細(xì)胞分析可使ADO的發(fā)生率從23.8%下降到3.8。在今后的臨床工作中，盡量選取兩個或以上的卵裂球，同時擴(kuò)增多個微衛(wèi)星位點(diǎn)，以增加減少由于ADO引起的誤診率。    污染問題也是導(dǎo)致PGD誤診的又一重要因素，PGD的材料是單個卵裂球，其污染物主要來源于透明帶內(nèi)殘余的精子及母體的卵泡細(xì)胞，這樣應(yīng)用卵胞漿內(nèi)單精子注射，避免精子的污染，獲取的卵裂球經(jīng)多道PBS清洗。污染也可來自于空氣中的氣溶膠，在臨床診斷的過程中，應(yīng)嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作，避免人為的污染。本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)污染。 &#

18、160;  熒光PCR與常規(guī)PCR所不同的是將熒光染料標(biāo)記在寡核苷酸引物上，通過熒光的激發(fā)來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，該方法最突出的優(yōu)點(diǎn)是敏感性比常規(guī)PCR提高了1000倍，等位基因檢測的信號只有另一個等位基因的1甚至更少時，都能檢測出來，從而減少ADO現(xiàn)象引起的誤診。多重PCR同時擴(kuò)增多個微衛(wèi)星位點(diǎn)還可以避免由于基因重組引起的誤診。    總之，本研究應(yīng)用的單細(xì)胞多重?zé)晒釶CR，擴(kuò)增成功率高、ADO率低，同時擴(kuò)增多個微衛(wèi)星可以降低由于ADO和基因重組引起的PGD誤診，為ADPKD行PGD打下了基礎(chǔ)?！尽?#160; 1 Boucher C, Sandford R.

19、 Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD, MIM 173900, PKD1 and PKD2 genes, protein products known as polycystin-1 and polycystin-2). Eur J Hum Genet,2004,12(5):347354.2 梅長林,戴兵.多囊腎病慢性進(jìn)展的分子發(fā)病機(jī)制及進(jìn)展.中國實(shí)用內(nèi)科雜志，2007，27(1):5355.3 Burn TC, Connors TD, Dackowski WR, et al. Analysis of the genomic

20、sequence for the autosomal dominant polycystic kidney disease (PKD1) gene predicts the presence of a leucine-rich repeat. The American PKD1 Consortium (APKD1 Consortium). Human Molecular Genetics,1995,4(4):575582.4 Hughes J, Ward CJ, Peral B, et al. The polycystic kidney disease 1 (PKD1) gene encode

21、s a novel protein with multiple cell recognition domains. Nature Genetics,1995,10(2):151160.5 Mochizuki T, Wu G, Hayashi T. et al. PKD2 a gene for polycystic kidney disease that encodes an integral mem brane protein. Science (New York, NY,1996,272(5266):13391342.6 孫巖,丁蘭,王有麒,等.一個可能與PKD2基因連鎖的常染色體顯性多囊腎病家系.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2005，22(5):554556.7 Handyside AH, Kontogianni EH, Hardy K, et al. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature,1990,344(6268):768770.8 Verlinsky Y, Cohen J, Munne S, et al. Over a decade of experience with preimplantation