葉酸介導(dǎo)靶向砒霜納米粒的實驗研究

1、葉酸介導(dǎo)靶向砒霜納米粒的實驗研究         09-09-10 08:43:00     作者：劉海，朱亮    編輯：studa20【摘要】  目的 研究葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白的合成工藝，制備包裹砒霜的白蛋白納米粒并檢驗其對靶細胞的殺傷作用。方法葉酸在縮合劑的作用下與牛血清白蛋白偶聯(lián)，通過正交設(shè)計選擇最佳配方；用去溶劑法制備包裹砒霜的納米粒，并觀察其對靶細胞特異性殺傷作用。結(jié)果采用最佳條件合成的葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白的偶聯(lián)率

2、為30.31 g/mg，納米粒的砒霜包封率為10.3%，對靶細胞殺傷率為97%，對非靶細胞的殺傷力僅為23%。結(jié)論 包裹有砒霜的葉酸偶聯(lián)牛血清白蛋白納米粒（簡稱F-BSANP）對靶細胞有特異性殺傷作用。 【關(guān)鍵詞】  砒霜；納米粒；葉酸；牛血清白蛋白Abstract：ObjectiveTo study the synthetic procedure of folate-conjugated bovine serum albumin (F-BSA) and preparation of albumin nanoparticles entrapping arsenic trioxide，

3、and to examine the peculiar toxicity of nanoparticles on targeting cells.MethodsFolic acid was conjugated to bovine serum albumin via condensing agent，we studied the best synthetic formula of F-BSA by the orthogonal test designThe nanoparticles were prepared by desolvation method，and the peculiar to

4、xicity of F-BSANP on A549 was studiedResultsThe average conjugating rate of folate in F-BSA made in the best formula was 30.31g/mgThe entrapping rate of arsenic trioxide was 8.34%We examined the peculiar toxicity of F-BSANP on targeting cells and control group cells，respectively，and the death rate o

5、f targeting cells was 97 percent ,whereas that of control group was only 23 percentConclusionF-BSANP is peculiar to their targeting-cellsKey words：Arsenic trioxide；  Nanoparticles；  Folate；  Bovine serum albumin    腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命和健康的常見病和多發(fā)病，是導(dǎo)致殘疾和早死的主要疾病之一。目前，臨床使用的抗腫瘤化療藥物均

6、有較大的毒副作用，有些嚴(yán)重的毒副反應(yīng)是限制藥物劑量或使用的直接原因。研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤細胞(如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等)膜表面上的葉酸受體活性和數(shù)量顯著高于一般正常細胞，這為葉酸受體介導(dǎo)藥物靶向于腫瘤細胞的研究奠定了基礎(chǔ)1 。    中藥砒霜（三氧化二砷）是中藥中的傳統(tǒng)毒藥，近年來有關(guān)其抗腫瘤作用，尤其是在我國率先開展的三氧化二砷治療急性早幼粒細胞性白血病(APL)的研究引起了人們的廣泛興趣；研究已發(fā)現(xiàn)砒霜能顯著抑制人肺癌的細胞生長并誘導(dǎo)其凋亡2 。但是,在治療過程中的嚴(yán)重毒副作用是影響其抗癌療效的主要原因。    本實驗以

7、傳統(tǒng)中藥砒霜為治療藥物，將其包裹在用葉酸偶聯(lián)白蛋白制成的納米粒中，并進行其對靶細胞殺傷作用的研究。為以后制備其它抗癌藥靶向制劑作鋪墊。1 材料    人肺癌細胞株A549（購于武漢大學(xué)生命科學(xué)院中國典型培養(yǎng)物保藏中心）；人骨髓間充質(zhì)干細胞；分離自正常人骨髓血（骨髓血樣由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院一附院血液科提供）；牛血清白蛋白（上海新量化工試劑有限公司）；葉酸（上海新量化工試劑有限公司）；1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（簡稱EDC·HCl）（上海三杰生物技術(shù)有限公司）；Sephadex G-25 （Pharmacia）；三氧化二砷（購自上?；瘜W(xué)試劑采

8、購供應(yīng)站，CP）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)基（Gibco）；胰蛋白酶 1250（Amresco）。2  方法和結(jié)果2.1  葉酸偶聯(lián)白蛋白的合成2.1.1  葉酸偶聯(lián)白蛋白的合成與分離 將葉酸溶于pH7.4的磷酸緩沖液(PBS)中，加入EDC·HCl后攪拌活化5 min，再加入50 mg/ml牛血清白蛋白的PBS溶液，攪拌下反應(yīng)數(shù)小時即得3。將反應(yīng)液過Sephadex G-25柱，收集前段淡黃色有乳光部分4。2.1.2  因素和水平的確定經(jīng)過查閱相關(guān)文獻資料和大量的預(yù)實驗最終確定葉酸用量、E

9、DC·HCl與葉酸摩爾比、反應(yīng)時間3因素各取3水平優(yōu)化工藝。見表1。表1  因素水平（略）2.1.3  評價指標(biāo)的選取與測定葉酸與牛血清白蛋白偶聯(lián)越多，納米粒對腫瘤的靶向性就越高。因此選擇葉酸與牛血清白蛋白偶聯(lián)率作為評價指標(biāo)。    偶聯(lián)率的測定，將葉酸偶聯(lián)白蛋白溶于pH7.4的PBS中，用2.5%的胰蛋白酶消化2 h后離心取上清液于358 nm處測紫外吸收。標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，計算偶聯(lián)率。    偶聯(lián)率=被偶聯(lián)的葉酸量/g被偶聯(lián)的牛血清白蛋白量/mg2.1.4 正交實驗結(jié)果 按正交設(shè)計表L9(34)進行實驗，計算偶聯(lián)率（見表2），方差分析結(jié)果見表3。表2  正交設(shè)計（略）表3  方差分析表（略）    X1，X2和X3分別是各因素水平1、水平2、水平3偶聯(lián)率之和；X是各因素內(nèi)部水平1、水平2、水平3偶聯(lián)率之和的最大