外周血淋巴細胞攜帶風疹抗原與中樞神經感染風疹病毒的關系

1、    外周血淋巴細胞攜帶風疹抗原與中樞 神經感染風疹病毒的關系        【 摘要 】目的探討外周血淋巴細胞攜帶風疹病毒抗原與風疹病毒感染中樞神經系統(tǒng)的關系。 方法BALB/c小鼠分別給予臨床常用的可影響機體免疫功能的藥物，再經腹腔感染風疹病毒，并在感染后的1、3、7、14d觀察外周血淋巴細胞攜帶病毒抗原的情況，分析其與中樞神經系統(tǒng)病毒感染的關系。 結果地塞米松藥物組在不同時間抗原的平均攜帶率分別為3.1%、4.1%、9.6%、2.4%，環(huán)磷酰胺藥物組分別為1

2、4.2%、12.7%、9.9%、3.1%，未用藥物干預的感染組分別為4.63%、10.25%、6.88%、1.75%。方差分析顯示，3組動物在感染風疹病毒后的第24小時外周血淋巴細胞攜帶抗原存在明顯差異，F(xiàn)=0.0317，P<0.05。組間兩兩比較結果顯示：環(huán)磷酰胺藥物組動物外周血淋巴細胞抗原的攜帶明顯高于其它實驗動物組，地塞米松藥物組和藥物未干預組動物之間無明顯差異。確切概率法分析表明，動物外周血淋巴細胞風疹病毒的持續(xù)性攜帶與中樞神經系統(tǒng)風疹病毒感染的關系極為密切，P<0.001。 結論環(huán)磷酰胺可能影響風疹病毒感染后外周血淋巴細胞對病毒的攜帶率。在感染初期，外周血淋巴細胞持續(xù)攜帶

3、風疹病毒將增大中樞神經系統(tǒng)感染的機會?！?主題詞 】風疹病毒； 淋巴細胞； 中樞神經系統(tǒng)； 感染； 鼠 Antigen carry by peripheral lymphocytes and rubella virus infection in central nervous systemYAO Ping, SONG Yanyan, XU Hongzhi, et al.（Department of Virology, Shandong Medical University, Jinan 250012, P.R.China）【 Abstract 】ObjectiveTo investigate

4、the correlation between rubella virus antigen carry by peripheral lymphocytes and rubella virus infection in central nervous system(CNS). MethodsBALB/c mice were used as a model and treated with ordinary medicines affecting immunological functions. And then, the mice were infected via abdominal cavi

5、ty and the antigen carry situations in peripheral lymphocytes were examined at 1,3,7 and 14 days of the infection. Rubella viruses in CNS were detected by immunohistochemical methods. ResultsThe mean antigen carry rates at different times are 3.1%, 4.1%, 9.6% and 2.4%, respectively in the dexamethas

6、one group,14.2%, 12.7%, 9.9% and 3.1%, respectively in the cytoxan group. In the control group without any intervention, the rates are 4.63%, 10.25%, 6.88% and 1.75%, respectively. The antigen carry rates in peripheral lymphocytes among the three groups at 24 hours post infection are significantly d

7、ifferent (F=0.0317, P<0.05). Comparisions between groups showed that antigen carry rates in cytoxan group are much higher than those in other groups, but there was no difference between dexamethasone and control groups. The animals with persistent antigen carry were much easier to get cerebral in

8、fection than those with short term carry (P<0.001). ConclusionsCytoxan can affect virus carry rates in peripheral lymphocytes. At the early phase of infection, persistent carry of rubella virus in peripheral lymphocytes increases the opportunity of getting central nervous system infection.【 Subje

9、ct words 】Rubella virus; Lymphocyte; Central nervous system; Infection; Mouse 風疹病毒不僅可通過先天性感染引起胎兒中樞神經系統(tǒng)的損害，在人群中也可導致風疹病毒性腦炎1-4。在某些慢性風疹病毒感染的致病機理中，人們已開始關注外周血細胞對病毒抗原的表達在疾病發(fā)生中的作用5-7，但外周血細胞攜帶風疹病毒抗原與中樞神經感染的關系目前還不十分清楚。本研究通過觀察BALB/c小鼠外周血淋巴細胞攜帶風疹病毒及風疹病毒對小鼠中樞神經系統(tǒng)的感染，分析外周血淋巴細胞攜帶風疹病毒抗原在中樞神經系統(tǒng)感染中的作用。材料與方法動物：BALB/c

10、小鼠，共40只，體重1618克，雌雄各半，由本校實驗動物中心提供。動物實驗共設4組，每組10只。感染前，第1組動物腹腔給予地塞米松0.3mg/kg，連續(xù)5d給藥；第2組給予環(huán)磷酰胺30mg/kg，腹腔隔日給藥1周。第3組為沒有藥物干預的病毒感染組，第4組為正常對照組。無菌環(huán)境中飼養(yǎng)。病毒：風疹JR23株為本室分離鑒定8，滴度106TCID50/ml，BHK21增殖傳代，細胞病變達75%以上時收獲，室溫至-30凍融3次，2500r/min 30min，棄沉淀。10000r/min 30min，棄沉淀，留取上清液備用。第13組動物腹腔接種病毒105TCID50/ml，每只0.5 ml。動物外周血淋

11、巴細胞攜帶風疹病毒抗原的檢測：外周血細胞的采集：分別于病毒感染后1、3、7、14d，自動物尾靜脈取血20l，用白細胞稀釋液處理后，生理鹽水洗滌2遍，2000r/min離心20min，取沉淀涂片，晾干，95%乙醇固定15min，4保存?zhèn)溆?。間接免疫組織化學染色：方法見文獻9。第一抗體為本室制備的兔抗風疹血清，使用時以110稀釋。辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG為北京生物制品研究所產品，批號961，工作濃度150。底物為鄰苯二胺。鏡下觀察淋巴細胞，以棕黃色+的淋巴細胞為攜帶風疹抗原的陽性細胞，共計200個細胞，計算抗原攜帶百分率。BALB/c小鼠腦組織風疹病毒感染的檢測：病毒感染后第21天，常規(guī)處

12、死動物，取右半腦組織，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，常規(guī)制片，分別進行HE染色和免疫組織化學染色。用免疫組織化學染色ABC法檢測小鼠腦組織風疹病毒抗原，方法見文獻10。第一抗體為本室制備的兔抗風疹血清，血凝抑制抗體滴度為1160，使用時以150稀釋。豬血清白蛋白、第二及第三抗體均為VELTOR公司產品，其工作濃度分別為110、1100、1200。底物為DAB。鏡下觀察結果，以棕黃色+細胞為病毒感染陽性細胞，無棕黃染色細胞為病毒感染陰性。結果 1.實驗動物感染風疹病毒后的一般狀況：4組實驗動物，除第3組的2只小鼠在實驗操作中意外死亡，其余全部生存。在風疹病毒感染期間，動物未見生理及行為異常，無明

13、顯中樞神經系統(tǒng)的癥狀。2.不同組動物外周血淋巴細胞攜帶風疹病毒抗原的情況：在風疹病毒感染后的1、3、7、14d，地塞米松藥物組抗原的平均攜帶率分別為3.1%、4.1%、9.6%、2.4%；環(huán)磷酰胺藥物組分別為14.2%、12.7%、9.9%、3.1%；未用藥物干預的感染組分別為4.63%、10.25%、6.88%、1.75%，見表1。表1BALB/c小鼠病毒感染后不同時間外周血淋巴細胞風疹抗原的攜帶率Table 1. The carry rates of rubella antigens in peripheral lymphocytes of BALB/c mice after infect

14、ionGroupsAntigen carry rate after infection（%）1d3d7d14d13.104.109.602.40214.2012.709.903.1034.6310.256.881.754-*-* Negative result 用SAS統(tǒng)計軟件對動物外周血淋巴細胞攜帶抗原進行方差分析，結果為3組動物在感染風疹病毒后的第24小時外周血淋巴細胞攜帶抗原存在明顯差異，F(xiàn)=0.0317，P<0.05。組間兩兩比較結果顯示：環(huán)磷酰胺藥物組動物外周血淋巴細胞攜帶抗原明顯高于其它實驗組，而地塞米松藥物組和藥物未干預組動物之間差異無顯著性。雖然在感染后的第3、7、14天

15、環(huán)磷酰胺藥物組動物外周血抗原平均攜帶率均較其它實驗組高，但未見明顯的統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 3.BALB/c小鼠中樞神經系統(tǒng)風疹病毒的感染(1)受染小鼠腦組織風疹病毒抗原的檢測：在受染小鼠腦組織中，風疹病毒抗原主要分布于大腦灰質層。神經元細胞和膠質細胞均有風疹病毒的感染，神經元中的病毒抗原主要存在于細胞漿中，在聚集于神經元變性或壞死灶周圍的膠質細胞胞漿及胞核中也見有抗原的強染色區(qū)域。(2)不同組小鼠中樞神經感染狀況：在受風疹病毒感染的各組小鼠中，組織病變特點基本相同，以點狀或小灶性病理改變?yōu)橹?，可見神經元細胞的變性、壞死及膠質細胞增生，形成衛(wèi)星現(xiàn)象和噬神經元現(xiàn)象（見1）。免疫組化A

16、BC法檢測小鼠腦組織的風疹病毒抗原結果見表2。地塞米松組、環(huán)磷酰胺組和藥物未干預組的中樞神經系統(tǒng)風疹病毒感染率分別為60%、90%、50%。表2不同組小鼠腦組織風疹病毒抗原的檢出Table 2. Brain infected by rubella virus in different groups of BALB/c miceRubellaantigensDexamethasoneand infectiongroup(1)Cytoxan andinfectiongroup(2)Infectiongroup(3)Controlgroup(4)TotalNegative4141019Positiv

17、e694019Total1010810381風疹病毒感染BALB/c小鼠腦組織Fig 1. Rubella virus infected the brain of BALB/c miceThe neurons were focal degeneration and necrosis, accompanied by oligodendroglia and gliocytes proliferated around cytopathic areas that showed stellitosis and neuronophagia.HE staining (400×)4.外周血淋巴細胞連

18、續(xù)攜帶風疹病毒與中樞神經風疹病毒感染的關系： 通過對動物腦組織中風疹病毒感染的檢測，分析外周血淋巴細胞持續(xù)攜帶風疹病毒抗原與中樞神經病毒感染的關系發(fā)現(xiàn)，在外周血淋巴細胞持續(xù)攜帶風疹抗原的動物中，發(fā)生中樞神經系統(tǒng)病毒感染的比率高于短期攜帶抗原的動物，確切概率法分析表明，兩者差異具有極其顯著性，P<0.001（見表3）。表3外周血淋巴細胞連續(xù)攜帶風疹病毒抗原與腦組織風疹病毒的感染Table 3. The antigen persistence in peripheral lymphocytes and the cerebral rubella virus infection Persiste

19、nt timesof antigen carryBrain infected by rubella virusTotalPositiveratesNegativePositive27101758.82%318988.89%Total8182864.29%Fishers exact test：P=0.000515，P<0.001 討論在風疹流行期間，風疹病毒引起中樞神經感染的病例時有發(fā)生，約占風疹病例的0.3%1，2。臨床所見的風疹病毒性腦炎一般多發(fā)生于發(fā)病的一周內，這與病毒感染形成的病毒血癥密切相關。在此期間，病毒可能被外周血細胞攜帶，但外周血細胞攜帶風疹病毒抗原與中樞神經感染的關系目前

20、尚不十分清楚。曾有學者在鼠的傳代巨噬細胞中觀察風疹病毒的持續(xù)感染5，病毒初次感染后有(3550)%的細胞產生病毒抗原，(0.051.5)%的細胞產生感染性病毒顆粒，持續(xù)釋放的病毒滴度可達(102107) TCID50/ml。如果發(fā)生再次感染，細胞表達抗原的比率及產生感染性病毒顆粒的細胞比率將分別增加到(7590)%和(3045)%。在風疹病毒持續(xù)性感染的病例中，也有在人的淋巴細胞中觀察到風疹病毒的報道6。結果提示，如果外周血中的某些細胞具有體外巨噬細胞相似的作用，就可能造成外周血持續(xù)性攜帶病毒抗原或組織中病毒的持續(xù)性感染。地塞米松和環(huán)磷酰胺為臨床常用藥物，長期使用會對宿主的免疫系統(tǒng)產生不同程度

21、的影響，增加病毒對機體的感染機會11。本實驗經腹腔分別給予第1組和第2組小鼠一定時期與一定劑量的地塞米松和環(huán)磷酰胺，并在此條件下感染山東地區(qū)風疹流行株RV-JR23，觀察BALB/c小鼠在不同藥物條件下，外周血淋巴細胞攜帶RV-JR23與中樞神經系統(tǒng)病毒感染的關系。結果表明，環(huán)磷酰胺藥物組動物在感染風疹病毒后的24h，外周血抗原攜帶率明顯高于其它實驗動物組，P<0.05。雖然在感染后的第3、7、14天環(huán)磷酰胺藥物組動物外周血抗原平均攜帶率均較其它實驗動物組高，但未見明顯的統(tǒng)計學意義（P>0.05），這可能與藥物作用在動物體內的衰減有關。實驗中我們還發(fā)現(xiàn)，各組動物外周血淋巴細胞持續(xù)攜

22、帶風疹病毒抗原與病毒感染中樞神經系統(tǒng)之間具有極顯著的統(tǒng)計學意義，P<0.001。結果提示，BALB/c小鼠在風疹抗體生成之前，外周血持續(xù)攜帶風疹病毒將增大中樞神經系統(tǒng)病毒感染的機會。風疹病毒感染BALB/c小鼠中樞神經系統(tǒng)后，動物不產生明顯的臨床癥狀，這可能與風疹病毒感染在腦組織中形成的病理學特征有關，病變以點狀或小灶性病理改變?yōu)橹?，無大片壞死或出血性病灶。由于本實驗未對外周血淋巴細胞病毒增殖情況進行觀察，故還不能確定病毒是否在外周血淋巴細胞內復制增殖?；痦椖浚荷綎|省衛(wèi)生廳資助項目(課題編號1995CACAA2)姚蘋（250012 濟南，山東醫(yī)科大學病毒學研究室）宋艷艷（250012

23、濟南，山東醫(yī)科大學病毒學研究室）許洪芝（250012 濟南，山東醫(yī)科大學病毒學研究室）王桂亭（250012 濟南，山東醫(yī)科大學病毒學研究室）劉言訓（統(tǒng)計學教研室）王志玉（250012 濟南，山東醫(yī)科大學病毒學研究室）參考文獻1，黃海，許猗，孫愛妹. 風疹合并腦炎78例臨床分析. 上海第二醫(yī)科大學學報, 1997, 17（5）:382-383.2，Mellinger AK, Cragan JD, Atkinson WL, et al. High incidence of congenital rubella syndrome after a rubella outbreak. Pediatr I

24、nfect Dis J, 1995, 14(7):573-578.3，李欣，李明林，楊志勇. 先天性TORCH感染腦CT表現(xiàn)：附7例分析. 中華放射學雜志, 1997, 31（3）:160-163.4，Date M，Gondoh M，Kato S，et al. A case of rubella encephalitis: rubella virus genome was detected in the cerebrospinal fluid by polymerase chain reaction. No To Hattatsu, 1995, 27(4):286-290.5，Sarmient