分泌人源性單克隆抗體永生化淋巴細胞系的構(gòu)建

1、    分泌人源性單克隆抗體永生化淋巴細胞系的構(gòu)建*        摘要目的：構(gòu)建分泌人源性單克隆抗體(McAb)的永生化B淋巴細胞系。方法：用正丁醇法提取的人卵巢癌細胞系ao10/17抗原在含免疫活化劑的無血清培基中免疫人淋巴細胞；將制備ao 10/17細胞DNA轉(zhuǎn)染經(jīng)體外免疫的淋巴細胞。采用ELISA篩選和有限稀釋法克隆化。結(jié)果：建成4株分泌抗卵巢癌McAb的轉(zhuǎn)染體細胞AT1、AT2、AT3和AT4；McAb相加試驗表明，它們識別卵巢癌抗原分子的同一表位。AT4已在體外培

2、養(yǎng)460多天，凍存復蘇后仍保持抗體產(chǎn)生能力。夾心ELISA發(fā)現(xiàn)，人源性McAb AT4能與卵巢癌細胞表面可溶性抗原發(fā)生免疫反應。結(jié)論：體外免疫和DNA轉(zhuǎn)染的結(jié)合，可建成分泌人源性McAb的永生化B淋巴細胞系，為人源性McAb的產(chǎn)生提供了一條技術途徑。主題詞淋巴細胞；抗體，單克??；轉(zhuǎn)染；免疫法；卵巢腫瘤 The construction of immortalized lymphoid cell lines secreting human monoclonal antibodiesWU Su-Yun, WEN Gan-Sheng, XU Fang-Yun, LIU Qiu-Ru, GONG We

3、n-Hua, Yu Ying, YI Wei-Min, LIU Si-SunDepartment of Pathophysiology and Tumor Immunology Research, Jiangxi Medical College, Nanchang(330006)Department of Obstetrics and Gynecology First Affiliated Hospital, Jiangxi Medical College Abstract AIM:To construct immortalized lymphoid cell lines secreting

4、human monoclonal antibodies. METHODS：Human lymphocytes were immunized in serum-free media containing immunoactive reagents using ovarian cancer cell line ao10/17 antigen extracted by 1-butanol. In vitro immunized lymphocytes were transfected with DNA preparations from ao 10/17. RESULTS：Four transfec

5、tant cell lines designated AT1, AT2, AT3 and AT4 secreting monoclonal antibodies against ovarian cancer were established by ELISA-based screening and limiting dilution. All of monoclonal antibodies were reactive with the identical epitopes of ovarian cancer-associated antigen molecule in the additio

6、n test. The transfectant cell line AT4 has grown continuously in vitro culture for more than 460 days and maintained the ability of secreting antibody after frozen and recovered. Human monoclonal antibody AT4 had immunoreactions with a soluble antigen from the cell surface of ovarian cancer by using

7、 sandwich ELISA.CONCLUSION：A combination of in vitro immunization and transfection with DNA induced the construction of B-cell-derived cell lines which secrete human monoclonal antibodies, and provide a technological approach for producing human monoclonal antibody.MeSHLymphocytes; Antibodies, monoc

8、lonal;Transfection; Immunization; Ovarian neoplasms人源性單克隆抗體(human monoclonal antibody, HMcAb)優(yōu)于鼠源性單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb)，但HMcAb制備的困難頗多，特別是人B淋巴細胞的抗原致敏和永生化。近年來采用體外免疫以致敏人B細胞，但其所需要條件還不很了解。EBV轉(zhuǎn)化雖可使致敏B細胞永生化，但因其存在諸多缺陷而甚少單獨采用。新近興起的基因工程抗體技術，人們寄予期望1。我們曾用DNA轉(zhuǎn)染技術構(gòu)建了兩株永生化鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)染體，它們能不斷產(chǎn)生抗宮頸癌McAb，并能在含血清

9、和無血清培基中長期生長2。本文報道，以低分子量卵巢癌細胞表面可溶性抗原體外免疫人脾細胞，用卵巢癌細胞DNA轉(zhuǎn)染經(jīng)體外免疫的人淋巴細胞；將所形成的轉(zhuǎn)化細胞進行篩選和克隆，構(gòu)建能產(chǎn)生抗卵巢癌HMcAb的永生化人轉(zhuǎn)染體淋巴細胞系。材料與方法(一)培養(yǎng)液、細胞和細胞系：1.基礎培養(yǎng)液：RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco),每升含5 mg胰島素，5 mg轉(zhuǎn)鐵蛋白，10 g硒，2 L 乙醇胺，0.3 g谷氨酰胺，0.11 g丙酮酸鈉，10 mg慶大霉素。2.人卵巢癌細胞系ao10/17：購自中國科學院細胞生物學研究所細胞庫，生長于含10%(V/V)FCS的RPMI 1640培基中。3.人卵巢癌細胞OV：

10、來自江西省婦產(chǎn)醫(yī)院經(jīng)確診的卵巢癌病人的腹水，離心后用PBS洗3次，備用或-70凍存。4.人脾細胞：來自一附院外科脾破裂病人手術切除的標本。切碎、通過200目不銹鋼網(wǎng)，Tris-NH4Cl處理5 min，制成懸浮細胞，備用或-70凍存。(二)人卵巢癌細胞表面可溶性抗原的制備：按本室報道的LeGrue正丁醇提取法的改良法3，將ao 10/17和OV細胞分別用2.5%正丁醇處理5 min，然后離心10 min，收集上清；將上清離心(15 000×g)30 min，透析，制得人卵巢癌細胞表面可溶性抗原，ao CBE和OVCBE，將前者進行SDS-PAGE測定。(三)人淋巴細胞體外免疫：1.體

11、外免疫培基制備：將基礎培基加入IL-2(2.5×104 U/L)和IFN-(4×105U/L)。2.體外抗原刺激：將制得的人脾細胞(3×109/L)懸浮于體外免疫培基中；加入ao CBE(6 mg/L)，24 h后加入FCS(終濃度為15%)；置于37，7% CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)15 d，其間每隔4 d加入20%體外免疫培基。獲得的致敏人淋巴細胞供DNA轉(zhuǎn)染用。(四)卵巢癌細胞ao 10/17 DNA轉(zhuǎn)染致敏淋巴細胞：按我們發(fā)表的Jonak等的方法的改良法2并參照Sambrook等的方法4制備DNA和DNA共沉淀物并將后者轉(zhuǎn)染致敏淋巴細胞。(五)淋巴細胞轉(zhuǎn)染體產(chǎn)生的

12、特異性抗體的檢測：按間接ELISA3：用包被緩沖液稀釋ao CBE至5 mg/L，酶標板每孔加入50 L，4孵育過夜；加入50 L轉(zhuǎn)染體細胞培養(yǎng)上清液(以正常人脾細胞培養(yǎng)上清液為陰性對照)，37孵育2 h；最后加入底物(OPD)溶液50 L，37孵育30 min。終止后，以酶標儀測定A490 值。(六)轉(zhuǎn)染體細胞克隆化：96孔培養(yǎng)板加入BALB/C小鼠脾細胞，將針對ao CBE的特異性IgG抗體陽性反應轉(zhuǎn)染體細胞，按有限稀釋法做單克隆細胞培養(yǎng)。(七)轉(zhuǎn)染體McAb的制備：將克隆3次的轉(zhuǎn)染體細胞在含10%小牛血清培基中擴大培養(yǎng)，其培養(yǎng)上清液用硫酸銨沉淀。(八)HRP標記McAb AT4：按Win

13、ston等5的方法，制成HRP-AT4。質(zhì)量鑒定后，分裝、凍存。(九)McAb夾心ELISA的建立：按本室以前報道的方法3。(十)McAb的表位特異性分析：按Friguet等6報道的ELISA McAb相加實驗測定McAb的抗原識別表位。(十一)McAb的效價測定：用間接ELISA測定轉(zhuǎn)染體細胞培養(yǎng)上清液的效價。(十二)McAb的特異性鑒定：用間接和夾心ELISA測定McAb與ao CBE和OVCBE的免疫反應。結(jié)果(一)癌細胞DNA轉(zhuǎn)染誘導體外免疫人淋巴細胞永生化：從人卵巢癌細胞系ao 10/17提取的DNA，其A260/A280比值為1.8-1.9；用其制得的DNA共沉淀物轉(zhuǎn)染經(jīng)ao CB

14、E(SDS-PAGE測定為低分子量抗原，24.552.3 kD)體外致敏的人淋巴細胞。1. DNA轉(zhuǎn)染淋巴細胞的形態(tài)學：轉(zhuǎn)染后第8 d，在倒置相關顯微鏡下可見轉(zhuǎn)化細胞灶，轉(zhuǎn)化細胞體積較淋巴細胞大，略顯大小不一，密度較未轉(zhuǎn)化細胞高，但仍保持典型的淋巴樣細胞形態(tài)。第2周可見簇狀的轉(zhuǎn)化細胞集落，其細胞數(shù)量迅速增加。第8周可見多種形態(tài)的淋巴樣細胞集落(1)。8個月后，細胞緊密貼壁，其間有明顯基質(zhì)(2)。Fig 1 Inverted phase-contrast photomicrograph of immortalized human lymphoid cell line established by

15、 in vitro immunization and DNA transfection. Eight weeks after transfection (magnification ×33) 1體外免疫和DNA轉(zhuǎn)染建立的永生化人淋巴細胞系(轉(zhuǎn)染后8周)Fig 2 Inverted phase-contrast photomicrograph of immortalized human lymphoid cell line established by in vitro immunization and DNA transfection. Eight months after tran

16、sfection (magnification ×132) 2體外免疫和DNA轉(zhuǎn)染過后的永生化人淋巴細胞系(轉(zhuǎn)染后8個月)2.DNA轉(zhuǎn)染體淋巴細胞的篩選、克隆化和永生化：在轉(zhuǎn)染后第2周出現(xiàn)轉(zhuǎn)化細胞時，用間接ELISA檢測DNA轉(zhuǎn)染體淋巴細胞培養(yǎng)上清液與卵巢癌抗原ao CBE的免疫反應。將IgG抗體陽性反應轉(zhuǎn)染體細胞按有限稀釋法進行3次克隆化，獲得4株DNA轉(zhuǎn)染體淋巴細胞系，命名為AT1、AT2、AT3和AT4。經(jīng)ELISA McAb相加試驗證明，它們均針對卵巢癌細胞表面可溶性抗原分子同一表位。選擇其中1株AT4轉(zhuǎn)染體細胞系進行研究；迄今，AT4已經(jīng)過460多天連續(xù)培養(yǎng)，McAb的分泌

17、持續(xù)穩(wěn)定，凍存復蘇后依然如此。上述結(jié)果說明，體外免疫和DNA轉(zhuǎn)染人淋巴細胞，可使其永生化，并產(chǎn)生McAb。二、卵巢癌轉(zhuǎn)染體McAb的特性：1.McAb的效價：將轉(zhuǎn)染體細胞系AT4的培養(yǎng)上清液用PBS進行倍比系列稀釋后，用間接ELISA測定，測得其效價為164。2.McAb的特性：在間接和夾心ELISA中，McAb AT4能與人卵巢癌細胞表面可溶性抗原ao CBE和卵巢癌病人腹水中癌細胞表面可溶性抗原OVCBE發(fā)生免疫反應(表1)。說明人源性 McAb AT4能識別卵巢癌相關抗原。表1ELISA測定McAb AT4與卵巢癌細胞CBE和正常人血清的反應Tab 1 Reactivity of McA

18、b AT4 with CBE of ovarian cancer cellsand normal serum in ELISASample obsorbanceRatio of sample absorbanceat 490to control absorbanceao CBE0.532.7OVCBE0.9254.87NS0.19ao=ovarian cancer cell line ao10/17; OV=ovarian cancer cells of ascites from a patient with ovarian cancer;CBE=crude butanol extract;

19、NS=serum of normal females討論(一)DNA轉(zhuǎn)染誘導B細胞永生化：人源性McAb雖難以采用雜交瘤技術制得，但可用DNA轉(zhuǎn)染、EBV感染、人淋巴細胞在SCID小鼠中構(gòu)建以及基因工程技術特別近年發(fā)展的抗體組合文庫技術以制備適于臨床應用的HMcAb;這些技術各有特點，可相互取長補短。本研究采用DNA轉(zhuǎn)染經(jīng)ao CBE體外免疫的人淋巴細胞，構(gòu)建4株永生化轉(zhuǎn)染體細胞系，它們能不斷分泌針對人卵巢癌細胞表面可溶性抗原的McAb，說明DNA轉(zhuǎn)染技術可構(gòu)建永生化抗體產(chǎn)生淋巴細胞系。(二)體外免疫構(gòu)建McAb產(chǎn)生細胞：Kawahara等7研究了人淋巴細胞體外致敏所需的免疫活化劑，認為胞壁肽

20、，白介素類是必需的；用此法獲得的McAb, IgG比IgM多1倍以上，抗體產(chǎn)生效率比體內(nèi)自發(fā)免疫大10倍。Niedbata等8應用EBV感染技術制備人源性McAb時，以含IL-2(2.5×104U/L)和低劑量IFN-的培基進行體外致敏。本研究采用體外免疫人淋巴細胞時，在無血清培基中只加了很低劑量的IL-2和IFN-，建成的4株淋巴細胞轉(zhuǎn)染體均分泌IgG McAb。(三)體外致敏抗原：目前制得的HMcAb通常是識別胞質(zhì)抗原而不是細胞表面抗原。本研究用正丁醇法3制得的低分子量ao CBE經(jīng)體外免疫人淋巴細胞，建成了轉(zhuǎn)染體淋巴細胞系，其所分泌的McAb能與卵巢癌細胞表面抗原和可溶性抗原以

21、及卵巢癌組織，發(fā)生免疫反應9，10，并能通過CDC和ADCC殺仿靶腫瘤細胞(另文發(fā)表)。本研究結(jié)果表明，卵巢癌細胞表面可溶性抗原體外免疫和DNA轉(zhuǎn)染人淋巴細胞，可建成分泌HMcAb的永生化B淋巴細胞系。因此，體外免疫技術和分子生物學永生化的結(jié)合有希望成為產(chǎn)生HMcAb的一條技術途徑。* 國家自然科學基金(39460031)和江西省自然科學基金(94516)資助作者單位：鄔淑云溫淦升徐方云劉秋如龔文華余鷹江西醫(yī)學院病理生理教研室、腫瘤免疫研究室(南昌330006)婦產(chǎn)科易為民劉絲蓀江西醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院參考文獻1Glassy MC. Production methodes for generat

22、ing human monoclonal antibodies. Hum Antibody Hybridomas, 1993, 4:154.2Wu SY, Wen G S. DNA-transfectant cell lines producing monoclonal antibodies. Chin J Pathophysiol, 1995, 11:114.3Wu SY, Wen GS. Studies on monoclonal antibody AU14-1 and immunology of uterine cervical cancer. Chin J Pathophysiol,

23、1997, 13:437.4Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T.eds. Molecular clonong, a laboratory manual. 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Prees, 1989. 1638.5Winston S E, Fuller S A, Evelegh M J, et al. Conjugation of enzymes to antibodies. In:Ausuble FM, Brent R, Kingston RE, et al.eds. Short protocols in molecular biology.3rd ed. Vo