實(shí)驗(yàn)性變態(tài)性腦膜炎

1、實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎(Experimental allergical encephalomyelitis,EAE中山醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)病學(xué)教研室 胡學(xué)強(qiáng) 饒從志目 錄一 . 簡介 -二 . 前言 -三 . 方法介紹 -(一 動(dòng)物的選擇 -(二 致腦炎抗原的種類 , 選擇和制備 -(三 致敏途徑和不同 EAE 的誘導(dǎo)方法 -(四 評價(jià) -1.臨床評價(jià) -2.病理評價(jià) -3.生化 , 免疫方面評價(jià) -4.影像學(xué) , 電生理評價(jià) -(五 EAE 的防治 -四 .EAE 的應(yīng)用價(jià)值 -五 . 參考文獻(xiàn) -實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎一 . 簡介實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎 (Experimental aller

2、gical encephalomyelitis,EAE是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生的 一種變態(tài)反應(yīng)性疾病。由神經(jīng)組織 (或病毒 誘導(dǎo)產(chǎn)生的局限在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)反應(yīng)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)型自身 免疫病。根據(jù)致敏的方式和動(dòng)物不同的遺傳背景,可誘導(dǎo)出不同病程的臨床和病理過程的 EAE , 并用于作 為研究人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的動(dòng)物模型。本文將介紹 EAE 的建立及評價(jià)方法。二 . 前言實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎 (Experimental allergical encephalomyelitis,EAE是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生的 一種變態(tài)反應(yīng)性疾病。由神經(jīng)組織 (或病毒 誘導(dǎo)產(chǎn)生的,由淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的,以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)血管周 圍單

3、核細(xì)胞浸潤和白質(zhì)脫髓鞘為特征的變態(tài)反應(yīng)性疾病。根據(jù)致敏方法的不同,可誘導(dǎo)敏感動(dòng)物產(chǎn)生超急 性、急性和慢性過程的 EAE ,并長期作為人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的動(dòng)物模型, 為探討其病因、發(fā)病 機(jī)制以及藥物試驗(yàn)性治療療效觀察提供研究材料和對象。三 . 方法介紹(一 動(dòng)物的選擇不同種屬動(dòng)物對 EAE 敏感性不同, 因而 EAE 的建立與選擇的動(dòng)物種屬關(guān)系很大。 經(jīng)免疫遺傳研究發(fā)現(xiàn) EAE 的發(fā)生受遺傳因素制約, EAE 的易感性受免疫反應(yīng)基因 ( Ir基因 影響,它直接控制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對抗原刺激的 免疫反應(yīng) 1。 Ir 基因調(diào)節(jié)作用主要表現(xiàn)在:T 細(xì)胞參與作用, T 細(xì)胞表面呈現(xiàn) Ir 基因?qū)?MBP

4、 特異性表達(dá), 在 識別相同的 MHC 類抗原下,對致敏腦炎抗原產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng),因此 T 細(xì)胞表面有對 MBP 特異性 Ir 基因表達(dá)的受體能控制和決定 EAE 易感性。此受體能與 MBP 的特異性致腦炎抗原決定簇結(jié)合,而使腦炎發(fā)生 2。 研究證實(shí)對 EAE 高度抵抗的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 T 細(xì)胞上缺乏對 MBP 反應(yīng)的受體,所以不能發(fā)生 EAE 。長期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究認(rèn)為最適合作為研究對象的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是鼠、兔、猴,但由于它們種類不同對 EAE 敏 感性也就不同。鼠:Lewis 鼠對 EAE 非常敏感; SJL/J、 SWR/J鼠對 EAE 也很敏感; 中國的 KM 鼠對 EAE 也敏感; 而 Bow-N

5、orway 鼠、 Balb/c鼠對 EAE 有高度抵抗性,證實(shí) B-N 鼠和 Balb/c鼠 T 細(xì)胞上缺乏對 MBP 反應(yīng)的受體 1,3。兔:日本大耳白兔和新西蘭白兔對 EAE 敏感。證實(shí)兔類 Ir 基因位于 17 號染色體短臂上 4。猴:恒河猴和食蟹猴對 EAE 敏感,證實(shí)決定其易感 EAE 的因子之一是 MHC-DPB1等位基因 5,6,7。 建立不同種屬動(dòng)物的 EAE ,應(yīng)選擇條件為:612周齡、不同窩別、雌雄均有的敏感鼠; 510月齡、 2.03.0kg(體重 、不同窩別的、雌雄均有的敏感兔; 34歲、 34kg(體重 、不同窩別的、雌雄均有 的敏感猴。(二 致腦炎抗原的種類、選擇和

6、制備EAE的致腦炎抗原具有器官特異性,而沒有種屬特異性, 存在所有溫血?jiǎng)游镏袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的白質(zhì)內(nèi) 8。從始至今使用的致腦炎抗原的種類有:同種型、 異種型或同種異型溫血?jiǎng)游锏娜X、脊髓組織或其 中的白質(zhì) (Rivers, 1933年 ,髓素蛋白脂蛋白 (Hitherto,1958年 ,髓素堿性蛋白 (Kiers,1965年 , 用消 化酶分解后的肽片 (Dale,1974年 , 蛋白脂阿樸蛋白 (Rosemarie,1982年 , 大腦內(nèi)皮細(xì)胞膜 ( Rose,1987年 以及 MBP-特異性 T 淋巴細(xì)胞。另外,還有人用過病毒如單純皰疹型病毒 (Hocherg,1977年 。用以上這些 抗原可以

7、誘導(dǎo)出超急性、急性、慢性 EAE ?，F(xiàn)今選擇使用較多的致腦炎抗原是溫血?jiǎng)游锶X或脊髓組織中的白質(zhì)、提取的純化 MBP 以及分解后 MBP 肽片段和人工合成的 MBP 肽片段。另外, 還有蛋白脂阿樸蛋白。其制備方法見下圖:溫血運(yùn)動(dòng)腦或脊髓組織中的白質(zhì)(新鮮凍存于 -70以下 (W/V=1/1加 PBS(PH7.2在低溫下用勻漿機(jī)制成白質(zhì)勻漿 酸化脫脂 取適量勻漿加 CFA(含 BCG2mg/ml (V/V=1/1MBP 人工合成的 MBP 肽片段水油乳化劑即可作致敏用蛋白脂阿樸蛋白加 CFA(含 BCG2mg/ml按 V/V=1/1圖 : 致腦炎抗原制備過程不同實(shí)驗(yàn)敏感動(dòng)物所需的致腦炎抗原的量不

8、同。其所需量大致如下:表 1. 不同實(shí)驗(yàn)敏感動(dòng)物所需的致腦炎抗原量-動(dòng)物 CNS中的白質(zhì) 水油乳化劑 MBP-鼠 1mg 0.10.2ml 12ug兔 50mg 0.20.25ml 100200ug猴 200mg 0.50.6ml 400600ug-(三 致敏途徑和不同 EAE 的誘導(dǎo)方法致腦炎抗原的兔疫途徑有多種:皮下、皮內(nèi)、肌肉、腹腔和靜脈注射。經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)皮下多部 位注射致腦炎抗原誘發(fā) EAE 的發(fā)生率最高, 因而常用的注射途徑是皮下注射 9。EAE的產(chǎn)生不僅與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和致腦炎抗原有關(guān)外, 而且與致敏方法密切相關(guān)。由于致敏方法的不同, 可誘導(dǎo)產(chǎn)生超急性、急性和慢性病程的 EAE 。

9、 具體實(shí)施方案如下:若給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一次注射大劑量致敏原和CFA ,同時(shí)注射百日咳菌苗, 動(dòng)物免疫后 78天發(fā)病,這就是超急性 EAE ; 若給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一次注射較大劑 量的致敏原和 CFA ,動(dòng)物在注射后 2周左右發(fā)病,這就是急性 EAE ; 若給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物間隔一周注射較小劑量的 致敏原和 CFA ,急性起病后有緩解復(fù)發(fā)的病程,或急性 EAE 經(jīng)不當(dāng)治療也可有緩解復(fù)發(fā),這些均是慢性復(fù)發(fā) 性 EAE(Cr-EAE10。(四 EAE 的評價(jià)1.臨床評價(jià)超急性 EAE 動(dòng)物起病非常迅速,死亡率高,大部分動(dòng)物立即癱瘓, 迅速進(jìn)入昏迷,最后死亡。急性 EAE 急性起病 , 呈單相病程。表現(xiàn)為突然出現(xiàn)肢體乏力,

10、尤其是后肢,繼之癱瘓,共濟(jì)失調(diào)步態(tài), 震顫,括約肌失禁,約三分之一或二分之一患病動(dòng)物進(jìn)入昏迷,最后死亡,其余動(dòng)物呈現(xiàn)不同程度恢復(fù)。 慢性 EAE 起病較慢,呈緩解復(fù)發(fā)病程,表現(xiàn)為視力下降,體重下降,肢體乏力,厭食,共濟(jì)失調(diào)步態(tài) 等。具體臨床評分見下表 7:表 2. 臨床評分表-臨床表現(xiàn) 得分-無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、體征 0嗜睡、厭食、體重下降 1共濟(jì)失調(diào)、震顫、抽搐 2盲、截癱、偏癱 3四肢麻痹,四肢癱 4死亡 5-2.病理評價(jià) 8超急性 EAE 腦和脊髓白質(zhì)內(nèi)廣泛血管壁壞死和灶性出血,纖維素沉著, 血管周圍炎性細(xì)胞浸潤,主要 是多核細(xì)胞。急性 EAE 髓鞘崩解脫失,腦脊髓內(nèi)小血管周圍炎性細(xì)胞浸潤,

11、 即“血管套”形成,小血管壁炎性細(xì)胞 浸潤,血管壁炎性增生,病灶播散在整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)內(nèi),常靠近腦室系統(tǒng)附近。另外,注射局部有 炎癥反應(yīng),甚至有潰瘍形成,局部淋巴結(jié)腫大。慢性復(fù)發(fā)性 EAE 中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)內(nèi)血管周圍有細(xì)胞浸潤,伴有脫髓鞘 -髓鞘再生斑,以及膠質(zhì)疤痕形 成。3.生化 , 免疫方面評價(jià) 5,6,7超急性 EAE 特異性抗 MBP IgE抗體升高,生物活性物質(zhì)升高等,符合速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。急性 EAE Th升高, Ts 下降, TNF 升高, INF 下降, IL-2、 6、 10、 12升高, Sz1-2R升高, CNS 鞘內(nèi) IgG 合 成量升高,合成率升高, IgG 組分區(qū)

12、帶陽性, MBP 及其抗體升高,符合遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。慢性復(fù)發(fā)性 EAE 其免疫、生化改變同急性 EAE 。4.影像學(xué)、電生理評價(jià) 11,12電子計(jì)算機(jī) X 線斷層掃描 (CT可發(fā)現(xiàn)腦部早期病變,主要是散在、多發(fā)、 大小不一的白質(zhì)低密度灶, 主要是散在、多發(fā)、大小不一的白質(zhì)低密度灶,較對稱地散布在腦室周圍,大腦中央部白質(zhì)、腦干和小腦 腳。急性期和復(fù)發(fā)加重期,病灶可增多,部分可強(qiáng)化。穩(wěn)定期病灶可縮小。核磁共振影像 (MRI是更有價(jià)值的檢查方法,對 EAE 的評價(jià)有很高的價(jià)值 11。病灶主要表現(xiàn)多為散在 分布和融合兩種。病灶可累及腦室旁、胼胝體、大腦半球白質(zhì)、腦干、小腦和脊髓等。病灶的信號強(qiáng)度隨 疾

13、病的不同階段及使用的掃描參數(shù)而變化,在急性期和進(jìn)展期, T1加權(quán)像多表現(xiàn)為等信號或略低信號, T2加權(quán)則多表現(xiàn)為高信號。在慢性穩(wěn)定期, T1加權(quán)呈均勻的低信號,邊界清楚, T2加權(quán)像呈均勻高信號。 電生理檢查以腦誘發(fā)電位價(jià)值較大,能檢測出中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)病變,有時(shí)甚至是臨床下隱匿性病灶, 為臨床評價(jià)提供客觀依據(jù) 12。臨床上常進(jìn)行視、聽覺及體感誘發(fā)電位檢查。其主要表現(xiàn)為潛伏期延長、 波形異常、波幅降低甚至平坦。 (五 EAE 的防治EAE的藥物試驗(yàn)有多種方法能防止 EAE 的發(fā)生。例如 (1 據(jù)報(bào)道采用一次大劑量注射同種型神經(jīng)組織給 新生鼠可導(dǎo)致無免疫反應(yīng), 多數(shù)新生鼠不發(fā)生 EAE ; (2采

14、用皮下或腦內(nèi)注射純化致腦炎抗原后再免疫動(dòng)物, 亦可抑制 EAE 的發(fā)生; (3預(yù)先單純注射佐劑 CFA 后,再免疫動(dòng)物,亦可防止 EAE 的發(fā)生; (4 在注射后盡早 摘除注射局部淋巴結(jié)或行局部放療,也將防止 EAE 的發(fā)生。EAE同其它自身免疫病一樣,可用免疫抑制劑如皮質(zhì)類固醇、 硫唑嘌呤和環(huán)磷酰胺等藥物治療。 目前正在試行以下方法抑制和預(yù)防 EAE 的發(fā)生:(1有 MBP(鞘內(nèi)注射、口服 ,共聚物 -,脾細(xì)胞結(jié) 合 MBP 多肽, MHC 結(jié)合多肽,脂質(zhì)體結(jié)合人 MBP 多肽等可阻滯抗原識別,從而阻止或抑制 EAE 發(fā)生; (2用嵌合型 CD4單抗、抗 TCR 單抗、抗粘附分子單抗、抗 M

15、HC 單抗等作用于激活的 T 細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫反應(yīng),從而 抑制 EAE 的發(fā)生; (3接種 T 細(xì)胞、 TCR 多肽能抑制、預(yù)防 EAE 發(fā)生; (4用 PAF 拮抗劑 (銀杏內(nèi)酯 保護(hù)血腦屏 障,從而抑制 EAE 。國外,現(xiàn)已試用上述的一些方法治療人類多發(fā)性硬化 ( MS患者,但結(jié)果尚未肯定,有 些方法尚有待摸索、改進(jìn) 13四 .EAE 的應(yīng)用價(jià)值長期以來研究認(rèn)為 EAE 與人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病無論在臨床表現(xiàn)、病理、以及免疫發(fā)病機(jī)制等 方面都極為相似, 因而作為研究人類脫髓鞘疾病的動(dòng)物模型 14,15。早已公認(rèn)超急性 EAE 、急性 EAE 是人 類急性出血性壞死性腦炎 (AHLE、 急

16、性播散性腦脊髓炎 (ADEM的動(dòng)物模型,但不能完全代表人類 AHLE 和 ADEM, 在發(fā)病機(jī)制方面, AHLE 和 ADEM 還有一些問題尚未解決。EAE和 MS 的關(guān)系是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)問題。采用 EAE 研究人類 MS 的發(fā)病機(jī)制已進(jìn)行了幾十年,但其病因和 發(fā)病機(jī)制至今未明。研究中不斷發(fā)現(xiàn)急性 EAE 和 MS 有些方面雖然相似,但存在許多不同之處,而慢性復(fù)發(fā) 性 EAE(Cr-EAE更接近 MS ,是研究 MS的最佳模型。早在 1933年 Rivers 在猴建立 Cr-EAE 以來,許多學(xué)者如 Raine(1984年 、 Cohen(1986年 和 Mackey(1973年 等采用各種方

17、法建立了不同種屬動(dòng)物的 Cr-EAE ,并將 Cr-EAE 與 MS 進(jìn)行了詳細(xì)比較,認(rèn)為 Cr-EAE 在臨床上有緩解、復(fù)發(fā)病程, CNS 內(nèi)存在原發(fā)性脫髓鞘斑和班塊 融合現(xiàn)象、膠質(zhì)增生反應(yīng)等;免疫改變有 Th 升高, Ts 下降, IL-2、 6、 10、 12, Sz1-2R 升高, IgG 組分區(qū)帶, IgG 合成率升高, MBP 及其抗體升高等,這些改變與 MS 極其相似,是研究 MS 的最佳模型,尤其是 Cr-EAE 更 是如此 10,16。但在致病因子、臨床、病理、免疫反應(yīng)等方面與 MS 還有一些不同之處,表現(xiàn)在如下方面: (1致 Cr-EAE 的致敏原明確,是由 MBP 中的腦

18、炎因子所致,但 MS 是何種抗原引起的疾病至今未明,大多 數(shù)學(xué)者認(rèn)為 MS 是與病毒感染、遺傳、自家免疫以及環(huán)境、內(nèi)分泌等有關(guān)的多致病因素疾病。(2Cr-EAE的整個(gè)進(jìn)程比 MS 更急性,更象急性 MS ,而多數(shù) MS 的過程進(jìn)展慢, 病程一般數(shù)年數(shù)十年。(3Cr-EAE脊髓病變區(qū)常位于脊髓表面,而 MS 病變區(qū)主要位于白質(zhì)深層。(4細(xì)胞免疫反應(yīng)證實(shí), EAE 系細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng),以細(xì)胞免疫介導(dǎo)為主,而 MS 尚未獲得充分 證據(jù)證明是遲發(fā)性超敏反應(yīng)。(5慢性 EAE 有不同的動(dòng)物模型,比較發(fā)現(xiàn)猴 Cr-EAE 較鼠、兔 Cr-EAE 更近于 MS 。綜上所述,研究急性和慢性 EAE ,

19、揭示了 CNS 炎性脫髓鞘疾病的病理現(xiàn)象,詳細(xì)了解 CNS 內(nèi)細(xì)胞和體液 免疫機(jī)制在發(fā)病機(jī)制中的重要作用。 這些結(jié)果將為研究人類脫髓鞘疾病提供了重要資料。雖然慢性 EAE 不 能完全代替 MS ,但對于研究 MS 的病理過程、發(fā)病機(jī)制以及觀察各種治療效果都十分有價(jià)值。五 . 參考文獻(xiàn)1.Vincert KT, et al. Myelin proteolipid protein- induced experimental allergic encephalomyelitis. Variations of disease expression in different strains of mic

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