多重聚合酶鏈反應(yīng)用于D－K型沙眼衣原體基因分型的研究

1、    多重聚合酶鏈反應(yīng)用于DK型沙眼衣原體基因分型的研究        【摘要】目的摸索一套泌尿生殖道沙眼衣原體基因分型的多重聚合酶鏈反應(yīng)法。方法選擇某一型與其它各型均不同的可變區(qū)部位作為下游引物，以恒定區(qū)1區(qū)的高度保守區(qū)作為各型的公用上游引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)株和臨床野生株的多重聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，并與聚合酶鏈反應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶片段多態(tài)性方法比較。結(jié)果用摸索出的反應(yīng)系統(tǒng)和條件，對(duì)8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出與理論值一致的片段，并可直接在普通水平瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。特異性檢

2、測(cè)證明：衣原體各型之間沒(méi)有非特異性交叉擴(kuò)增，對(duì)泌尿生殖道病原和寄生微生物進(jìn)行擴(kuò)增，未擴(kuò)出任何DNA帶。對(duì)臨床野生株分型結(jié)果證明：復(fù)合聚合酶鏈反應(yīng)陽(yáng)性率為100，而聚合酶鏈反應(yīng)限制性?xún)?nèi)切酶片段多態(tài)性為94.44。結(jié)論本套衣原體基因分型的多重聚合酶鏈反應(yīng)法特異、敏感、快速、實(shí)用，最終能用于臨床分型?！娟P(guān)鍵詞】衣原體，沙眼聚合酶鏈反應(yīng)基因型Genotyping of Chlamydia trachomatis Isolates by a Multiplex PCRLIU Quanzhong, CHEN Jinying, JIAO Wenling, et al.(Tianjin Institute o

3、f Sexually Transmitted Diseases. Tianjin 300052)【 Abstract】 Objective To establish a multiplex PCR genotyping method for Chlamydia trachomatis isolates. Methods With the aid of the special gene software, the homogenicity of C.trachomatis D K omp1 gene was analysed, and the primers for genotyping wer

4、e designed accordingly. The differences of amplified products of each genotype were over 80 bp so that they could be distinguished on agarose gel electrophoresis. The multiplex PCR was applied to test the reference and wild strains and was compared with PCR RFLP method. Results After repeated experi

5、ments, each reference strain was amplified to reveal a clear band by the multiplex PCR which could be differentiated with each other on agarose gel electrophoresis. All wild strains could be genotyped by the multiplex PCR while 94.44 of the strains could be genotyped by PCR RFLP. Conclusion The mult

6、iplex PCR genotyping method for C.trachomatis is a sensitive, specific, convenient and practical tool for clinical application.【 Key words】 Chlamydia trachomatis Polymerase chain reaction Genotype沙眼衣原體(Ct)是非淋菌性尿道炎(NGU)的主要致病菌，部分可引起附睪炎、前列腺炎、輸卵管炎、盆腔炎、感染后不孕等嚴(yán)重并發(fā)癥，但約50的男性、70的女性患者臨床無(wú)癥狀或癥狀很輕微1。這些不同狀態(tài)與衣原體不同

7、型的致病性有關(guān)。由于目前的分型方法均難以用于臨床，迄今缺乏Ct大規(guī)模臨床分子流行病學(xué)調(diào)查，難以確定不同型與所致疾病的關(guān)系。我們擬摸索一套特異、實(shí)用的泌尿生殖道沙眼衣原體基因分型的多重聚合酶鏈反應(yīng)法。材料和方法一、標(biāo)本來(lái)源(一)標(biāo)準(zhǔn)株：18個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株中，15個(gè)Ct血清型標(biāo)準(zhǔn)株由加拿大Sherbrooke大學(xué)Frost博士惠贈(zèng)：AG17/OT、BTW5/OT；CTW3/OT；DUW3/CX；EUW5/Cx；FUW55/Ur；GUW57/Ur；HUW4/Cx；IUW12/u；JUW36/Cx；KATCCVR887；L1LiCM440，L2LLCM434/Bu；L3LLCM404，TE55/C由中國(guó)科學(xué)

8、院薛慶富研究員提供。Ba/Ap2由荷蘭Free大學(xué)的LanJar博士提供。L2/434/Bu、E/NS1由協(xié)和醫(yī)院病毒室倪安平博士提供。(二)臨床野生株:36份已被細(xì)胞培養(yǎng)法證實(shí)為Ct陽(yáng)性的標(biāo)本,來(lái)源于我所臨床診斷為NGU患者的尿道或?qū)m頸拭子標(biāo)本,男26例,女10例,年齡1839歲。二、方法(一)臨床標(biāo)本采集:用文獻(xiàn)2的方法。(二)細(xì)胞培養(yǎng):用文獻(xiàn)3的方法。(三)標(biāo)本處理:50L標(biāo)準(zhǔn)株或臨床野生株培養(yǎng)液，離心沉淀后，加裂解液（50mmol/LKCl,2.5mmol/LMgCl2,10mmol/LTrisHClpH8.3,0.1g/L明膠，0.45NP40,0.45吐溫20，蛋白酶K200mg/

9、L）20L,6515min，9510min。染色體DNA按文獻(xiàn)4抽提。(四)PCR限制性酶切長(zhǎng)度多態(tài)性分析(PCRRFLP)分型：按Frost等報(bào)道5設(shè)計(jì)引物,序列為：outer1,5ATGAAAAAACTCTTGAAATCGG3，outer2序列為5TTTCTAGA(T/C)TTCAT(T/C)TTGTT3，由日本大連寶生物有限公司合成。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1077bp。反應(yīng)體系：10×反應(yīng)緩沖液5L、dNTPs5L（各200mol/L）、上下游引物各0.3mol/L、Taq酶1U、模板DNA510L、去離子水20L。模板DNA,每株5L。反應(yīng)條件及產(chǎn)物的酶切電泳參考文獻(xiàn)6,但染液為0.

10、5g/mL濃度的溴化乙錠。(五)多重PCR分型：1.引物設(shè)計(jì)：選擇某一型與其它各型均不同的部位作為下游引物，而以恒定區(qū)1區(qū)的高度保守區(qū)作為各亞型擴(kuò)增公用的上游引物，用金鑰匙掃描程序證明各引物特異，用引物報(bào)告篩選中符合引物條件。檢測(cè)9條引物之間有無(wú)互補(bǔ)、或存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體,亞型的擴(kuò)增片段大小?；ハ嘀g差別要80bp，經(jīng)篩查和精選，選出的引物見(jiàn)表1。2.擴(kuò)增系統(tǒng):10mmol/LTrisHCl(pH8.3),50mmol/LKCl,2.5mmol/LMgCl2,dNTPs0.3mmol/L,引物：上游0.6mol/L,下游各0.3mol/L,Taq酶0.5U,模板DNA40ng,雙蒸水加至25

11、L。擴(kuò)增條件：94預(yù)變性300s后,94變性45s,60退火45s,72延伸60s,30個(gè)循環(huán)后,72延伸600s。擴(kuò)增產(chǎn)物取5L于2瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠0.5g/L）電泳，在紫外線(xiàn)燈下觀(guān)察結(jié)果。結(jié)果一、omp1擴(kuò)增1.標(biāo)準(zhǔn)株:17個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株樣品均擴(kuò)增出1條1077bp的預(yù)期擴(kuò)增片段。見(jiàn)1。2.野生株:36個(gè)經(jīng)DNA抽提的標(biāo)本有34個(gè)擴(kuò)增出預(yù)期的1077bp的片段。二、基因分型1.PCRRFLP基因分型：8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株RFLP分型結(jié)果見(jiàn)2。2.復(fù)合PCR基因分型：對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株的擴(kuò)增：用上述反應(yīng)系統(tǒng)和條件，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增出與理論值一致的片段。見(jiàn)3。對(duì)引物特異性檢測(cè)：衣原體各型之間沒(méi)有非特異

12、性擴(kuò)增。我們對(duì)泌尿生殖道病原微生物和寄生微生物：大腸桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、鏈球菌、八疊球菌、乳酸桿菌、糞腸球菌、陰溝腸桿菌、醋酸鈣不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食單孢菌、淋球菌、陰道加德鈉菌、解脲支原體共18種(來(lái)自我院細(xì)菌室及我所實(shí)驗(yàn)室，已經(jīng)培養(yǎng)分離鑒定)進(jìn)行擴(kuò)增，未擴(kuò)出任何DNA帶。三、兩種方法的比較1.標(biāo)準(zhǔn)株:8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株兩種方法檢測(cè)出相應(yīng)的Ct陽(yáng)性結(jié)果。2.野生株:復(fù)合PCR基因分型:對(duì)36株野生株標(biāo)本全部擴(kuò)增出與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)株相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性帶，有2份為混合型，鑒定結(jié)果:E:14株，F(xiàn):8株，D:5株，G:3株，J:2株，H:2株，F(xiàn)/E混合

13、:2株，陽(yáng)性率100。PCRRFLP:36株野生株標(biāo)本擴(kuò)增出34份陽(yáng)性的omp1帶。進(jìn)行酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析，有32份與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)株相對(duì)應(yīng)，推斷為該型，有2份難以判定屬于哪一型，按已有的方法應(yīng)判為混合型，但難以進(jìn)一步判斷是哪兩型的混合。鑒定結(jié)果:E:13株，F(xiàn):8株，D:4株，G:3株，J:2株，H:2株，混合:2株，陽(yáng)性率為94.44。同一標(biāo)本復(fù)合PCR法與PCRRFLP法分型結(jié)果相同。表1沙眼衣原體D-K型復(fù)合PCR的引物序列引物種類(lèi)引物預(yù)期擴(kuò)增片段上游共用引用5'-CCGACCGCGTGTGAAAACAGATGT-3'下游引物D型5'-GTAAGATCAAGAG

14、GCAATTCTTT-3'547bpE型5'-TCCTTAAGGTATCCGCTAGA-3'235bpF型5'-CAATTGCAGTTAGCTCCAGC-39344bpG型5'-CTCCGTTGTTGGATCGTTGA-3'100bpH型5'-CGACGTCAAGTGGAAATTCCG-3'514bpI型5'-TCAGCCAGTTCGTTGGTTTTCTTT-3'819bpJ型5'-TCAGCCAGGTGGTTATCGTT-3'721bpK型5'-TAGGCTGAGGATACCCATCG-3

15、'674bp     討論 血清學(xué)分型雖然建立較早，但所用標(biāo)本應(yīng)是純Ct，需要細(xì)胞培養(yǎng)，分離、連續(xù)傳代。大約有4280的分離株可在傳代中丟失，另外需一大組單克隆抗體(McAb)，而McAb很難獲得，并未商品化，難以廣泛應(yīng)用。因此血清學(xué)分型一直停留在少數(shù)實(shí)驗(yàn)室的研究水平上。近年來(lái)基因研究的進(jìn)展使得Ct的分型達(dá)到了新的水平，這些方法包括PCRRFLP、可變區(qū)測(cè)序、全染色體基因分型、RAPD以及SSCP等，其中PCRRFLP方法因不需作細(xì)胞培養(yǎng)，2d可完成一批臨床標(biāo)本的分型，可用于臨床而倍受推崇，被國(guó)內(nèi)外的一些實(shí)驗(yàn)室所采納6,7，被認(rèn)為是最有前途廣泛應(yīng)

16、用于臨床的分型方法。從本文結(jié)果可以看出，用PCRRFLP分型，與標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)比，大部分野生株可以鑒定其型別，有一些則比較含糊，如2例混合感染的形。可能是由于Ct型之間同源性很高，酶切后，Ct各型之間的片段相同的很多，不同的很少,當(dāng)有混合感染，那些微小區(qū)別進(jìn)一步減少，結(jié)果難以判斷。    118個(gè)標(biāo)準(zhǔn)株ompl基因擴(kuò)增結(jié)果（M：PCR Marker）    2沙眼衣原體D-K型ompl基因RCR-RFLP分型結(jié)果    3沙眼衣原體D-K型 多重PCR基因分型結(jié)果我們?cè)谟?jì)算機(jī)輔助下

17、設(shè)計(jì)DK這8個(gè)型的引物時(shí)，選擇某一型與其它各型均不同的部位作為下游引物，而以恒定區(qū)1區(qū)的高度保守區(qū)作為各型擴(kuò)增公用的上游引物，這樣既保證了不同型擴(kuò)增的特異性，又保證了所擴(kuò)增出來(lái)的片段只是衣原體omp1基因上的，保證了分型的高度特異，用金鑰匙掃描程序證明各引物特異，用引物報(bào)告篩選中符合引物條件。另一方面，減少了7條引物，這就極大地減少了引物之間的干擾和互補(bǔ)。引物確定后,我們先以一定的反應(yīng)系統(tǒng)優(yōu)化反應(yīng)條件，當(dāng)反應(yīng)條件優(yōu)化確定后又反回來(lái)優(yōu)化反應(yīng)系統(tǒng)的一些成分的濃度，優(yōu)化好反應(yīng)系統(tǒng)后，再試驗(yàn)已確定的反應(yīng)條件是否適應(yīng)新的反應(yīng)系統(tǒng)，如此多次反復(fù)，才確定適應(yīng)于本套復(fù)合PCR的最佳反應(yīng)系統(tǒng)和擴(kuò)增條件。其中最主

18、要的優(yōu)化變量是Mg?濃度和退火溫度。雖然引物的退火溫度在某種程度上是可以計(jì)算的，但以我們的結(jié)果所示，一方面很多的引物對(duì)難以有一個(gè)統(tǒng)一的退火溫度點(diǎn)；另一方面，即使經(jīng)過(guò)平衡找到某一溫度，也須經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)來(lái)摸索更合適的退火溫度，因?yàn)槎嘀豍CR的條件幾乎必然要憑經(jīng)驗(yàn)修改8。由于本實(shí)驗(yàn)的退火溫度較高，敏感性在加入臨床標(biāo)本時(shí)有所降低，我們除調(diào)整Taq酶、加Taq酶前煮沸外，還加了增強(qiáng)劑25二甲基亞砜（DMSO）在特異性和產(chǎn)物產(chǎn)量的敏感性上有所改善。本文結(jié)果顯示：Ct分型PCRRFLP的敏感性低于復(fù)合PCR，原因尚不完全清楚。一方面由于酶切需要足夠量的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)體積通常在50100L，而較大體積的樣

19、品加熱和冷卻的效率不如小體積高。另一方面，PCR反應(yīng)的長(zhǎng)度對(duì)擴(kuò)增效率有影響，模板給予長(zhǎng)PCR產(chǎn)物的信號(hào)弱于給予短PCR產(chǎn)物的信號(hào)。最佳是在250750bp之間，過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短擴(kuò)增效率都可能下降,本文復(fù)合PCR絕大多數(shù)片段都在最佳范圍內(nèi),而PCRRFLP則為1077bp。劉全中（天津性傳播疾病研究所300052）陳錦英（天津性傳播疾病研究所300052）繳穩(wěn)苓（天津性傳播疾病研究所300052）田靜群（天津性傳播疾病研究所300052）傅志宜（天津性傳播疾病研究所300052）參考文獻(xiàn)1，Hillis S,Black C,Newhall J,et al.New opportunities for C

20、hlamydia prevention: applications of science to public health practice. Sex Trans Dis,1995,22:197 202.2， Pozniak A.Sexually transmitted diseases and urinary tract infections.Curr Opin Infect Dis, 1999,12:33 34.3，劉全中,繳穩(wěn)苓,陳錦英.HeLa229細(xì)胞平皿培養(yǎng)法檢測(cè)非淋菌性尿道炎患者的沙眼衣原體.天津醫(yī)藥，1999,27:369370.4， Frost EH, Deslandes S, Bourgaux Ramoisy D.Chlamydia trachomatis serov