喹諾酮類抗菌藥耐藥新機制

1、喹 諾 酮 類 抗 菌 藥 耐 藥 新 機 制劉健華 , 陳杖榴(華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院 廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室 , 廣東 廣州 510642 中圖分類號 :S 859. 7文獻標識碼 :E 文章編號 :052926005(2007 0120054202近年來喹諾酮類的耐藥性問題備受關注 。 細菌對 喹諾酮類的耐藥機制過去普遍認為主要起因于染色 體基因突變 (靶位改變 、 主動外排和膜孔蛋白缺失 , 而不存在水平傳播的可轉移基因 。 近年來開始出現(xiàn)一 些新的喹諾酮耐藥機制 , 包括 qn r 、 m f pA 和氨基糖苷 乙酰轉移酶的變異基因 (aac (6 2Ib 2cr 介導的喹

2、諾 酮耐藥性 , 其中 qn r 和 aac (6 2Ib 2cr 位于質粒上 , 使 得喹諾酮耐藥性在人畜病原菌間的迅速擴散成為可 能 , 更加嚴重地威脅感染性疾病的治療 。收稿日期 :2006207205作者簡介 :劉健華 (19732 , 女 , 副教授 , 博士 , 從事獸藥安全評價和 細菌耐藥性研究 ; E 2m a il :jh liu scau . ed u . cn通訊作者 :陳杖榴 , E 2m a il :l . ed . 現(xiàn)就近年來新出現(xiàn)的喹諾酮類耐藥機制綜述如下 。 1 qn r 介導的耐藥機制1. 1 qn r 的發(fā)現(xiàn)及對喹諾酮類的作用機制 1998年 M artin

3、ez 等 1首次報道從美國阿拉巴馬州伯明翰醫(yī) 學中心分離的一株肺炎克雷伯氏菌中獲得了一個有 廣 泛 宿 主 菌 可 轉 移 喹 諾 酮 類 耐 藥 性 的 質 粒 pM G 252。 將該質粒轉入外膜孔蛋白缺失的肺炎克 雷伯氏菌可使其對環(huán)丙沙星的 M I C 升高 816倍 ,丙沙星的 M I C 升高 E . coli 轉化 100 0. 008m g L 上升到 L 。 這一質粒在其他腸桿菌 (如 E . coli 、 傷寒的檢測準確性好 。因素 , 其檢測結果應更為可靠 , 對檢測結果不相符的 尿樣進行萃取處理前后的檢測試驗說明 , TCC 、 B I O 和 DN 試劑盒對低含量或陰性

4、尿樣的直接檢測均存 在非特異反應的情況 。 而 CER 試劑盒對陰陽性尿樣 的檢測 (包括經(jīng)萃取處理的尿樣 均呈陽性 。 分析認 為 , 有兩方面因素 , 一方面可能該試劑盒本身不適合 用于尿樣的直接檢測 ; 另一方面 , 該試劑盒的反應活性 偏低 , 也可能影響了檢測結果的準確性 。 我們共采用了 6盒 CER 試劑 (含 3個批次 , 在試劑盒提供的操作程 序的基礎上 , 延長了個別反應步驟的時間 , 但不同試劑 盒的 0ng m l 標準的 OD 值均只達到 0. 91. 0ng m l 。 除了試劑盒自身因素 , 試劑在銷售和運輸過程中若儲 藏不當也可能造成反應活性偏低 。3. 4在實

5、踐工作中 , 確定合理陽性閾值對于 EL ISA 結果判定非常重要 。 一般而言 , 將陽性閾值定得較高 , 可減少非特異反應的情況 , 但也可能造成一些低殘留 水平的樣品漏檢 , 給進出口把關帶來風險 。 對陽性閾 值的確定 , 需綜合考慮所檢測藥物在動物體內(nèi)的殘留 規(guī)律 、 試劑盒本身的特點 、 樣品的前處理方法 、 把關要 求等因素 。3. 5尿樣的質量和前處理方法對檢測結果也有較大 影響 。 我們發(fā)現(xiàn) , 一些用原液測得含量為 1050ng m l 的尿樣 , 經(jīng) 10倍稀釋后用同一試劑盒測得含量為 0, 說明稀釋處理可減少一些干擾因素 。 為保證檢測質 量 , 尿樣應新鮮采集并注意低

6、溫保存 。 對尿樣采用本 研究介紹的有機溶劑萃取法或試劑盒提供的酶消化 法進行前處理 , 也可進一步減少干擾因素 。4小結綜上所述 , 根據(jù)本研究比對試驗結果 , 并綜合考慮 試劑盒檢測原理 、 質量 、 標準品設置 、 操作是否便利等 因素 , 4種試劑盒當中 , 本研究推薦選用 B I O 試劑盒進 行活動物萊克多巴胺殘留快速檢測 。但 B I O 試劑盒對 經(jīng)簡單處理的尿樣的檢測也存在非特異反應的情況 。 實際檢測工作中 , 除通過設定合理陽性閾值 、 對尿樣進 行必要的前處理等方法以盡可能較少非特異干擾因素 之外 , 還可對檢測呈陽性的樣品另用不同試劑盒檢測 , 綜合有關檢測結果進行判

7、定 , 必要時應采用色譜等方 法對 EL ISA 結果進行確證 。參考文獻 :1吳時清 , 陳茹 , 林志雄 , 等 . 應用競爭酶聯(lián)免疫吸附技術檢測供 港澳活豬中克倫特羅殘留量 J . 現(xiàn)代商檢科技 , 1999, 9(4 :172 18.2于洪俠 , 楊曙明 . 萊克多巴胺殘留檢測方法研究進展 J . 中國 獸藥雜志 , 2004, 38(11 :44247.3 Shelver W L , K i m H J , L i Q X . D evelopm ent of a monoclonal antibody 2based enzym e 2linked i m m uo so rbent

8、 asssy fo r beta 2 adrenergic agonist zilpatero l J . J A gric Food Chem . 2005, 53 (9 :327323280.4 Sm ith D J . Shelver W L . T issue residues of ractopam ine and urinary excreti on of ractopam ine and m etabo lites in ani m al treated fo r 7days w ith dietary ractopam ine J . J A ni m Sci , 2002,

9、80:124021249.5 D ick son L C , M ac N eil J D , L ee S , et a l . D eter m inati on of be 2 ta 2agonist residues in bovine urine using liquid ch rom atogra 2 phy 2tandem m ass spectrom etry J . J AOA C Int , 2005, 88(1 : 46256.45中國獸醫(yī)雜志 2007年 (第 43卷 第 1期 Ch inese Journal of V eterinary M edicine 沙門氏菌

10、 、 弗氏檸檬酸桿菌 和假單胞菌 (如銅綠假單 胞菌 都有廣泛的宿主菌并能表達喹諾酮類耐藥 性 1。 質粒 pM G 252的存在既不改變宿主菌外膜蛋白 的表達也不降低喹諾酮類在細胞內(nèi)的聚積 , 說明此質 粒介導了一種新的喹諾酮耐藥機制 。為了證明這種新的喹諾酮耐藥機制的存在 , T ran 和 Jacoby 2克隆了質粒 pM G 252上的喹諾酮類 耐藥基因 qn r (現(xiàn)命名為 qn r A , 并成功表達出 qn r A 蛋白 , 發(fā)現(xiàn) qn r A 蛋白能夠逆轉喹諾酮類對 DNA 旋 轉酶的抑制作用。 T ran 等 3進一步研究 qn r A 的作 用機制 , 發(fā)現(xiàn) qn r A

11、通過減少 DNA 促旋酶與 DNA 的 結合達到降低喹諾酮類藥物作用的全酶 2DNA 靶 位 , 從而保護 DNA 促旋酶不被喹諾酮類抑制 , qn r A 蛋 白 同 樣 可 以 保 護 拓 撲 異 構 酶 4。 M art nez 2 M art nez 等 5將質粒 pM G 252轉化到 gy r A 基因突變 的 菌株 、 接合轉移到多重耐藥操縱基因 m a rR 突變的 菌株 、 轉導入外膜蛋白 (o m p 缺失的菌株 , 發(fā)現(xiàn)后者對 喹諾酮類的 M I C 提高了 4128倍 , 提示 qn r A 能顯著 增強由于靶基因突變 、引起的耐藥性 。qn r 蛋白由 ,族 290,

12、一后重復出現(xiàn) A (D L XX , 其中 X 代表某種氨基 酸 。 在許多種細菌中發(fā)現(xiàn)這類蛋白 , 但在藍細菌中最 常見 , 既可作為膜蛋白 , 也可出現(xiàn)在細胞質中 。 1. 2 qn r A 的基因環(huán)境對不同來源的 qn r A 基因兩 側的基因環(huán)境進行分析 , 發(fā)現(xiàn) qn r A 基因位于基因結 構不同的屬 In 4家族的 類整合子上 2, 68。 攜帶 qn r A 的 類整合子的基因結構類似于整合子 In 6和 In 7, 共同結構從左到右依次為 :5 2CS (含 in tI 1 、 基 因 盒區(qū) 、 3 2CS 1(含 qacE 1和 su l 、 保守區(qū) CR 1 (含 orf

13、 513 、 特異區(qū)域 (含 qn r 和其他基因 、 3 2CS 2 (含 qacE 1和 su l , 除基因盒區(qū)域和特異區(qū)域外 , 其他基因結構都一樣 2, 68。 orf 513以前叫 orf 341, 編 碼捕獲耐藥基因的位點特異性重組酶 , 許多耐藥基因 (如編碼 2內(nèi)酰胺類 、 氯霉素類 、 大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素 類等的耐藥因子 發(fā)現(xiàn)與這種 CR 1和 orf 513有關 , 導 致耐藥基因播散 。 這些耐藥基因盒 , 包括 qn r A , 都丟 失了 59堿基元件 , 說明 orf 513的作用很有可能是位 點特異性捕獲耐藥基因 9。 qn r A 的啟動子序列與 CR 1的末

14、端重疊 , 提示 CR 1在 qn r A 耐藥基因的表達 上起了一定的作用 6。1. 3 qn r A 類似基因 H ata 等 10在分離自日本的福 氏志賀菌 2b 臨床分離株中發(fā)現(xiàn)一種新的介導喹諾酮 耐藥性的 qn r A 類似基因 (qn rS , 這種基因位于可轉 移的大小為 47kb 的質粒上 , 編碼的蛋白有 218個氨 基酸 , 與 qn r A 有 59%的氨基酸同源性 。 qn r S 與 qn r A 一樣僅介導低水平的喹諾酮耐藥性 。 最近德國研究人 員 從 禽 源 腸 炎 沙 門 氏 菌 中 檢 測 到 qn rS 基 因 (GenB ank 登錄號 AM 23472

15、2 , 這也是第一次有關動 物源細菌出現(xiàn)質粒介導喹諾酮耐藥性的報道 。近期 Jacoby 等 11從肺炎克雷伯氏菌中發(fā)現(xiàn)又一 質粒介導的喹諾酮耐藥基因 qn r B , 其編碼蛋白 qn r B 同樣屬五肽重復家族 , 與 qn r A 有 40%的氨基酸同源 性 , 柯氏檸檬酸桿菌 、 陰溝腸桿菌 、 E . coli 和腸炎沙門 氏菌中也檢測到 qn r B 11, 12。 從引起人類感染的非傷 寒沙門氏菌中檢測到 qn r B , 說明有可能通過食物傳 遞過來 , 這將是一個重要的公眾健康問題 12。1. 4 qn r 的起源 Po irel 等 13在研究 qn r 基因的起 源時 ,

16、 發(fā)現(xiàn)海藻希瓦菌存在 qn r A 類似蛋白 , 與 qn r A 僅有 24個氨基酸的差異 , 說明 qn r A 來源于海藻希 瓦菌 。 海藻希瓦菌屬革蘭氏陰性桿菌 , 廣泛分布在海 水和淡水環(huán)境中 。 從香港分離的腸炎沙門氏菌中檢測 到的 qn r A 類似蛋白與 qn r A 有 3個氨基酸差異 , 與來 自 海藻希瓦菌的 qn r A 314。 此外 , qn r A 和 qn, 分別為 66%、 15。 副溶血狐菌含有 qn r A 類似蛋 白 , 與 qn r A 有 58%的氨基酸同源性 , 與 qn rS 有 56%的同源性 15。 以上研究提示我們不僅獸醫(yī)領域的革 蘭氏陰性

17、桿菌 , 而且環(huán)境中的革蘭氏陰性桿菌也將成 為人類病原菌耐藥基因的儲存庫 。 喹諾酮類藥物同樣 用于水產(chǎn)養(yǎng)殖 , 推測水中亞抑菌濃度的喹諾酮類藥物 可能會選擇出水源海藻希瓦菌 , 從而促進喹諾酮耐藥 決 定 因 子 在 自 然 環(huán) 境 條 件 下 傳 遞 給 腸 桿 菌 科 細 菌 13。1. 5 qn r 的普遍性目前有關由 qn r 引起可水平傳 播的喹諾酮耐藥性的研究還較少 , 現(xiàn)有的研究結果也 表明 qn r 的普遍性不高 。到目前為止 , 先后有 10個國 家和地區(qū) (美國 、 中國內(nèi)地 、 埃及 、 法國 、 日本 、 德國 、 韓 國 、 土耳其 、 英國和中國香港 發(fā)現(xiàn)了可轉移

18、喹諾酮耐 藥性的質粒 , 大部分由 qn r A 基因介導 , 國內(nèi)先后從上 海 、 安徽和江蘇無錫分離的細菌中檢測到 qn r A 基因 。 qn r A 基因從肺炎克雷伯氏菌 、 E . coli 、 弗氏檸檬酸桿 菌 、 產(chǎn)酸克雷伯菌 、 陰溝腸桿菌 、 斯氏普羅維登斯菌和 腸炎沙門氏菌等多種細菌中檢出 。 qn r B 和 qn rS 的報 道還較少 。2 mf pA 介導的耐藥機制m f pA 是在研究喹諾酮類的外排泵時從恥垢分 支桿菌基因組中克隆出來的一個蛋白 , 介導了一種新 的喹諾酮耐藥機制 。 M on tero 等 16在野生型恥垢分 枝桿菌基因組中篩選到介導喹諾酮耐藥的開

19、放閱讀 框 m f pA , m f pA 編碼的蛋白在多拷貝質粒中表達時 , 可導致恥垢分枝桿菌對環(huán)丙沙星和司帕沙星低水平 耐藥 (M I C 升高 48倍 。在結核分枝桿菌中也發(fā)現(xiàn) 了 m f pA 蛋白的類似蛋白 2含有 183個氨基酸殘基的 55 Ch inese Journal of V eterinary M edicine 中國獸醫(yī)雜志 2007年 (第 43卷 第 1 期M t m fpA 蛋白 , 由 R v 3361c 基因編碼 , 與含有 192個氨 基酸殘基的 m f pA 蛋白有 67%的相似性 17。 m f pA 屬 于細菌五肽重復家族中的一員 , 每隔 4個氨基

20、酸有 1個亮氨酸或苯丙氨酸 。 H egde 等 (2005 17的研究表 明 , m f pA 是一種能夠模擬 DNA 的蛋白質 , 與 DNA 旋轉酶 A 結合而抑制其活性 。 DNA 模擬蛋白 m f pA 的發(fā)現(xiàn)為設計靶向作用于 DNA 結合蛋白的蛋白質提 供了平臺 , 為抗菌藥物的開發(fā)提供了新思路 。3氨基糖苷乙酰轉移酶介導的耐藥機制最近 , 美國哈佛醫(yī)學院的 Hoop er 等 (2006 18在 研究 qn r A 介導的喹諾酮類耐藥性時發(fā)現(xiàn)有些含 qn r A 的接合子對環(huán)丙沙星的 M I C 值為 1m g L , 較其他結 合子高 4倍 , 進一步通過基因敲除實驗證實這種較

21、高 水平的耐藥性是由與 qn r A 位于同一質粒上的氨基糖 苷乙酰轉移酶的變異基因 aac (6 2Ib 2cr 編碼的滅活 酶引起的 。 與 aac (6 2I 比較 , aac (6 2Ib 2cr 編碼區(qū) 5 端的 12個堿基完全不一樣 , 且在其編碼的氨基酸 102 (T rp A rg 和 179(A sp T yr 發(fā)生取代 , 這兩個位 點的取代與環(huán)丙沙星的耐藥性有關 。 該酶作用位點是 哌嗪環(huán)上的氨基氮 “ N H ” ,丙沙星和諾氟沙星 ,用 。 aac (6 2Ib 2cr率高 。的發(fā)現(xiàn)意義重大 , 推翻了以往認為喹諾酮類為全合成 藥物不被滅活酶水解的普遍觀點 , 且首次

22、發(fā)現(xiàn)細菌產(chǎn) 生的滅活酶可同時作用于兩種不相關的抗菌藥物 。 提 示在目前這種臨床抗菌藥物選擇性壓力下 , 當考慮現(xiàn) 存耐藥基因的進化趨勢時 , 我們應該開闊思路 。 變異 的氨基糖苷乙酰轉移酶的出現(xiàn) , 重新讓我們認識到了 微生物的強適應能力 。4展望雖然 qn r 、 m f pA 和 aac (6 2Ib 2cr 僅引起低水平 的喹諾酮類耐藥 , 但它們的存在有助于選擇出高水平 的喹諾酮類耐藥 2。 一般認為低水平耐藥性可使細菌 數(shù)量達到出現(xiàn)突變所需的濃度 , 從而出現(xiàn)高度耐藥 。 質粒介導喹諾酮類耐藥性的出現(xiàn) , 將加快喹諾酮類耐 藥性在細菌間的傳播 , 由于 qn r A 存在于 類整

23、合子 上 , 協(xié)同其他耐藥基因一起水平傳播 , 并促進這些耐 藥基因選擇出來 , 給臨床細菌性疾病的治療帶來更嚴 重的威脅 。 因此 , 將來應加強研究這種新的質粒介導 喹諾酮耐藥性的普遍性 (包括革蘭氏陽性菌 , 并進行 動物實驗研究活體情況下這些耐藥機制的臨床重要 性 。我國獸醫(yī)臨床分離細菌對喹諾酮耐藥性的迅速 發(fā)展 , 不僅與氟喹諾酮類藥物在我國獸醫(yī)臨床不加控 制地普遍使用有關 , 提示也可能存在喹諾酮耐藥性相 關的質粒 。 因此非常有必要在我國開展質粒介導喹諾 酮耐藥性的調(diào)查研究和耐藥機制研究 , 為防止喹諾酮 耐藥菌的產(chǎn)生 、 人畜病原菌間耐藥性的傳遞及藥物的 開發(fā)和臨床合理使用提供

24、理論依據(jù) 。參考文獻 :1 M art nez 2M art nez L , Pascual A , Jacoby G A . Q uino lone re 2 sistance from a transferable p las m id J . L ancet , 1998, 351 (9105 :7972799.2 T ran J H , Jacoby G A . M echanis m of p las m id 2m ediated quin 2 o lone resistance J . P roc N atl A cad Sci U SA , 2002, 99(8 : 56382

25、5642.3 T ran J H , Jacoby G A , Hooper D C . Interacti on of the p la 2 s m id 2encoded quino lone resistance p ro tein qn r w ith E scherich ia coli DNA gyraseJ. A nti m icrob A gents Chemo ther, 2005, 49 (1 :1182125.4 T ran J H , Jacoby G A , Hooper D C . Interacti on of the p la 2 s m id 2encoded

26、 quino lone resistance p ro tein qn r A w ith E scherich ia coli topo isom erase I V J . A nti m icrob A gents Chemo ther , 2005, 49(7 :305023052.5 M art nez 2M art nez L , Pascual A , Garc a I , et a l . Interacti on of p las m id and ho st quino lone J . J A nti m icrob , 2003, 4 .6, V e oo , Po L

27、 , et a l . Em ergence of id 2in E scherich ia coli in J . m icrob A gents Chemo ther , 2005, 49(1 :712 76.7 W ang M , T ran J H , Jacoby G A , et a l . P las m id 2m ediated quino lone resistance in clinical iso lates of E scherich ia coli from Shanghai , Ch ina J . A nti m icrob A gents Chemo ther

28、 , 2003, 47 (7 :224222248.8 Jeong J Y , Yoon H J , K i m E S , et a l . D etecti on of qnr in clinical iso lates of E scherich ia coli from Ko rea J . A nti m icrob A gents Chemo ther , 2005, 49(6 :252222524.9 Partridge S R &H all R M . In 34, a comp lex In 5fam ily class 1 integron containing orf 5

29、13and df r A 10J . A nti m icrob A gents Chemo ther , 2003, 47(1 :3422349.10H ata M , Suzuk i M , M atsumo to M , et a l . C loning of a novel gene fo r quino lone resistance from a transferable p las m id in S h ig ella f lex neri 2b J . A nti m icrob A gents Chemo ther , 2005, 49(2 :8012803.11Jaco

30、by G A , W alsh K E , M ills D M , et a l . qnr B , ano ther p las m id 2m ediated gene fo r quino lone resistance J . A nti 2 m icrob A gents Chemo ther , 2006, 50(4 :117821182.12Gay K , Robicsek A , Strah ilevitz J , et a l . P las m id 2m ediated quino lone resistance in non 2T yph i sero types o

31、f Sal monella enterica J . C lin Infect D is , 2006, 43(3 :2972304.13Po irel L , Rodriguez 2M artinez JM , M amm eri H , et a l . O rigin of p las m id 2m ediated quino lone resistance deter m inant qn r A J . A nti m icrob A gents Chemo ther , 2005, 49(8 :352323525. 14Cheung T K , Chu Y W , Chu M Y

32、 , et a l . P las m id 2m ediated resistance to ci p rofloxacin and cefo taxi m e in clinical iso lates of Sal monella enterica sero type Enteritidis in Hong Kong J . J A nti m icrob Chemo ther , 2005, 56(3 :5862589.15Saga T , Kaku M , O nodera Y , et a l . V ibri o parahaemo lyticus ch romo som al

33、qnr homo logue V PA 0095:demonstrati on by transfo r m ati on w ith a m utated gene of its po tential to reduce quino lone suscep tibility in E scherich ia coli J . A nti m icrob A gents Chemo ther , 2005, 49(5 :214422145. 磺胺二甲基嘧啶殘留快速檢測試劑條的研究王浩 1, 林松 1, 魯強 1, 朱加虹 2, 張少恩 1(1. 博頓生物檢驗技術 杭州 有限公司 , 浙江 杭州

34、 310022;2. 浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質量標準研究所 , 浙江 杭州 310021中圖分類號 :S 859. 84文獻標識碼 :B 文章編號 :052926005(2007 0120057202磺胺類藥物殘留的檢測通常采用酶聯(lián)免疫吸附 法 (EL ISA 、 高效液相色譜法 (H PL C 及氣質聯(lián)用法 (GC 2M S 等 2, 但這些方法有操作時間長 、 費用高 、 操作技能強等缺點 , 不易推廣 。 隨著人們對食品安全 的日益重視和食品進出口貿(mào)易的高速增長 , 迫切需要 一種能快速檢測農(nóng) 、 獸藥殘留的方法 。 近年來 , 膠體金 檢測技術已廣泛應用于小分子物質的檢測 3, 4,

35、本試 驗采用此技術研制了一種快速檢測牛奶中磺胺二甲 基嘧啶殘留的膠體金試劑條 , 具有靈敏度高 、 特異性 強 、 操作簡便 、 成本低廉等優(yōu)點 ,闊 。1材料與方法1. 1(S M 2 、 牛 血清 白 蛋 白 (B SA 、 卵 清 白 蛋 白 (OVA 、 氯 金 酸 (HA uC l 4 4H 2O 、 檸檬酸三鈉和 PEG 20000購自 Sigm a 公司 ; 磺胺二甲基嘧啶 EL ISA 檢測試劑盒 , 購 自 R andox 公司 ; B radfo rd 蛋白定量試劑盒 , 購自 B i o 2 R ad 公司 ; XYZ 3050型 三 維 噴 點 平 臺 , 購 自 美

36、國 B i oDo t 公司 ; 硝酸纖維素膜 (N C 膜 、 膠體金結合墊 、 樣品墊 、 吸水墊 、 背襯 , 購自 M illi po re 公司 。1. 2人工抗原的合成 S M 2與 B SA 和 OVA 的偶聯(lián) 物 合成方法為重氮法 , 具體方法 5如下 :以 4m l 0. 5 N H 2SO 4溶解 57m g S M 2; 將 19m g N aNO 3溶解于 1 m l 蒸餾水中 , 緩慢加入上液中 ; 將此混合溶液轉入 4 m l 碳酸緩沖溶液中 (pH 10. 0, 含 100m g B SA 或 100 m g OVA ; 4過夜后 , 以生理鹽水透析 72h ,

37、所得產(chǎn) 物 -20保存 。 利用紫外吸收光譜對半抗原與蛋白質 的偶聯(lián)物進行鑒定 , 并計算結合比 6。1. 3多抗的制備以 S M 22B SA 偶聯(lián)物作為免疫原 , 免疫新西蘭白兔 , 免疫方案如下 :0. 5m g S M 22收稿日期 :2005208204作者簡介 :王浩 (19792 , 男 , 工程師 , 本科 , 從事農(nóng)藥 、 獸藥殘留快 速檢測生產(chǎn)研發(fā)工作 B SA 抗原與等體積福氏完全佐劑乳化后 , 背部皮下 多點注射 ; 此后每隔 2周 , 取 0. 5m g S M 22B SA 抗原與 等體積福氏不完全佐劑乳化后 , 加強免疫 5次 。 以免 疫雙擴散法測定血清效價 , 待效價高于 1 32后 , 采 血 , 用飽和硫酸銨及 P ro tein A 親和純化 , 制備 S M 2多 克隆抗體 。1. 4膠體金及抗 S M 2PA b 金標的制備取 100m l 0. 01%1. 0m l m in , 冷卻后用 0. 2 l 0, 攪拌下加入抗 S M 2 , 30m in , 逐滴加入 2m l 25m g m l PEG 20000, 攪拌 30m in ; 20000r m i