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文檔簡介
1、多色熒光原位雜交技術(shù)檢測急性淋巴細(xì)胞白血病復(fù)雜核型異常 作者:李建勇,馬力,肖冰,潘金蘭,仇海榮,吳亞芳,溫丙昭,薛永權(quán)【摘要】 本研究建立多色熒光原位雜交(M-FISH)技術(shù)平臺,探討其在檢測急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL)復(fù)雜核型異常中的應(yīng)用。聯(lián)合應(yīng)用常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法和M-FISH技術(shù)分析了5例伴有復(fù)雜核型異常的ALL患者。結(jié)果表明:M-FISH 證實了原有的異常t(9;22)、t(1;19)和 t(y;1),同時還發(fā)現(xiàn)了新的異常der(1)(137)、der(6) t(6;9)(q?;p13)、der(1)t(1;11)、der(12)t(1;12)、der(3)t(3;5)、der(2)
2、t(2;16)、der(9)(9187)和der(7)(9187),并且糾正了原有的錯誤分析,其中der(9)(9187)及der(7)(9187)為世界上首例報道。結(jié)論:M-FISH在檢測ALL復(fù)雜核型中的應(yīng)用前景廣闊,是進(jìn)行精確染色體核型分析所不可缺少的先進(jìn)手段。 【關(guān)鍵詞】 多色熒光原位雜交Detection of the Complex Chromosomal Aberrations in Acute Lymphoblastic Leukemia by Means of Multiplex Fluorescence in situ HybridizationAbstract This
3、study was aimed to establish the technique of multiplex fluorescence in situ hybridization (M-FISH) and to explore its usefulness in detection of complex chromosomal aberrations (CCAs) in acute lymphoblastic leukemia (ALL). Five ALL patients with CCAs were analyzed by combining the techniques of con
4、ventional cytogenetics (CC) and M-FISH. The results demonstrated that M-FISH confirmed the aberrations previously detected by CC,such as t(9;22),t(1;19) and t(y;1),and revealed new abnormalities as der(1)(137),der(6)t(6;9)(q?;p13),der(1)t(1;11), der(12)t(1;12),der(3)t(3;5),der(2)t(2;16),der(9)(9187)
5、 and der(7)(9187),and also corrected the wrong results in CC. Among these abnormalities,der(9)(9187) and der(7)(9187) were reported for the first time. In conclusion,M-FISH has proved to be useful in characterization of the CCAs in ALL,and it is an essential method to refine the karyotype analysis.K
6、ey words multiplex fluorescence in situ hybridization;acute lymphoblastic leukemia;complex chromosomal aberration伴隨血液系統(tǒng)疾病WHO分型的提出,細(xì)胞遺傳學(xué)已被提升到了更重要的地位。但是常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法對微小染色體重排或復(fù)雜核型分析效果較差,而熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,F(xiàn)ISH)技術(shù)又只能用1-2種探針來檢測證實已知的異常。這兩種方法都難以識別復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)改變和標(biāo)記染色體的來源。多色熒光原位雜交 (multiplex-
7、FISH,M-FISH)技術(shù)1則可以有效的解決上述難題。M-FISH技術(shù)在國外開展應(yīng)用相對較多,但國內(nèi)僅有趙萌等2應(yīng)用 M-FISH 技術(shù)檢測了2例急性白血病患者的核型異常。我們應(yīng)用M-FISH技術(shù)對5例伴有復(fù)雜核型異常(complex chromosomalberrations,CCAs)的急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia,ALL)病例進(jìn)行了檢測,以探討該技術(shù)在檢測ALL復(fù)雜核型異常中的應(yīng)用。材料和方法研究對象5例ALL患者,男4例,女1例,診斷和分型根據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色、多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)免疫分型和染色體核型分析確定,出現(xiàn)的染色體異常累計2
8、個以上染色體和(或)3個以上斷裂位點。例正常男性作為對照。細(xì)胞遺傳學(xué)分析采用骨髓短期培養(yǎng)法,按常規(guī)制備染色體。應(yīng)用R顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析,核型異常按人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN)1995加以描述。M-FISH分析M-FISH 探針為 Vysis 公司提供,以聯(lián)合標(biāo)記的方式共標(biāo)記SpectrumAquaTM、SpectrumGreenTM、SpectrumGoldTM、SpectrumRedTM、 SpectrumFRedTM 5種熒光素,用SpectraVysion 分析系統(tǒng)分析可得出24種不同的色彩分別標(biāo)記于每一條染色體上。M-FISH的具體步驟 取出儲存于-20的染色體標(biāo)本,氣干法
9、滴片,自然干燥后放入37 2SSC中老化30分鐘; 分別用RNA酶、胃蛋白酶及甲醛消化處理玻片,具體時間隨玻片上細(xì)胞多少及胞漿多少而定,用相差顯微鏡觀察確定; 72、70%甲酰胺/2SSC變性玻片2分鐘,室溫乙醇梯度脫水待干; 取出10 微升/1張玻片量的探針,72水浴5分鐘;加探針10 l于玻片上,上蓋22 mm22 mm蓋玻片,四周封膠,放入濕盒中37雜交12-18小時;第2天,取出玻片,揭去蓋玻片,放入72 0.4SSC/0.3% Tween-20中洗片2分鐘,再放入室溫2SSC/0.1% Tween-20中洗片1分鐘,待干; 加DAPI III 10 l 復(fù)染,1小時后看片。系統(tǒng)分析采
10、用SpectraVysion 分析系統(tǒng)及Leica DRMA2型熒光顯微鏡,按照順序換用 5 種濾光片,每一個分裂象分別于SpectrumGoldTM、SpectrumFRedTM 、SpectrumAquaTM、SpectrumRedTM和SpectrumGreenTM濾光片下采集5種熒光素的原始圖象,軟件分析合成最后的分類圖象,即每一條染色體被賦予一種偽彩(共24色),每一份標(biāo)本均采集約20個分裂象。結(jié) 果5例ALL患者具體情況見附表。 例正常男性對照的常規(guī)染色體和M-FISH均顯示正常男性核型:46,XY。5例ALL患者的中期分裂相較多,染色體分散好,故采集后合成的圖象效果較好。例1與例
11、2均有t(9;22)易位,已預(yù)示預(yù)后較差,但因其還具有其他復(fù)雜異常,經(jīng)M-FISH檢測后發(fā)現(xiàn),例1具有der(1)(137)、der(6)t(6;9)(q?;p13);例2則具有多個復(fù)雜異常:der(1)t(1;11)、der(12)t(1;12)、der(3)t(3;5)、der(2)t(2;16);例3為一超二倍體ALL患者,具有復(fù)雜異常,但因常規(guī)顯帶效果較差,未分清是何種異常,經(jīng)M-FISH證實為der(9) (9187)2與der(7)(9187)2;例4的M-FISH與常規(guī)核型分析相同,未發(fā)現(xiàn)新的異常;例5的常規(guī)核型分析發(fā)現(xiàn)較復(fù)雜,為47,XY,-4,11q-,14q+,der(15
12、),der(17),+mar1,+mar2,但M-FISH結(jié)果證實為48,XY,+1,t(1;14)(p32;q31)2,+der(2),-4,+der(7),del(11)(q14)。例正常對照和5例患者的M-FISH圖形見附圖。 Table. CC and M-FISH features of five ALL patients(略) 討 論眾所周知,細(xì)胞遺傳學(xué)對急性白血病患者的預(yù)后起重要作用,是急性白血病最重要的預(yù)后因素之一。但急性白血病患者的染色體制備較難,尤其是ALL患者,染色體易成團、成像粗糙、顯帶不清,常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析較困難。若ALL患者為CCAs,則分析更為困難。但是我們需要
13、明確CCAs,以便將其分為不同的細(xì)胞遺傳學(xué)亞型以指導(dǎo)治療,判斷預(yù)后。 目前,國際上開展M-FISH技術(shù)來明確急性白血病患者的CCAs。M-FISH技術(shù)是應(yīng)用5種熒光素同時標(biāo)記人類24條染色體,制備整套染色體涂抹探針,與待測病例的中期染色體分裂象進(jìn)行雜交,雜交后應(yīng)用配備有CCD冷式攝像系統(tǒng)與計算機圖象處理系統(tǒng)等裝置的熒光顯微鏡進(jìn)行檢測。M-FISH通過一次雜交即可檢測整套人類染色體的所有異常。 M-FISH在確定CCAs中起了重要作用,如確定復(fù)雜的結(jié)構(gòu)或數(shù)量異常,揭示隱匿易位,查明標(biāo)記染色體的來源等1-3。應(yīng)用該技術(shù)對ALL患者的研究尚不多。我們已知10%-34%的原發(fā)性AML患者與26.6%的
14、兒童ALL患者中存在CCAs4,5,但尚不清楚CCAs在成人ALL患者中所占比例。因此,我們應(yīng)用M-FISH技術(shù)檢測5例伴有CCAs的ALL患者,以探討M-FISH在檢測ALL復(fù)雜核型中的價值,為今后研究ALL的復(fù)雜核型異常建立一扎實的技術(shù)平臺。 通過本研究,我們建立了較穩(wěn)定的M-FISH技術(shù)平臺,成功地分析了5例ALL患者。這5例ALL患者均伴有CCAs,經(jīng)M-FISH檢測,證實了原有的異常,如t(9;22)、t(1;19)、t(y;1),同時還發(fā)現(xiàn)了新的異常,如der(1)t(137)、der(6)t(6;9)(q?;p13)、der(1)t(1;11)、der(12)t(1;12)、de
15、r(3)t(3;5)、der(2)t(2;16)、der(9)(9187)和der(7)(9187),其中der(9) (9187)及der(7)(9187)為目前世界上首例報道的核型異常。 M-FISH不僅發(fā)現(xiàn)與證實了常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果,還糾正了原有的錯誤分析。例5經(jīng)常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析結(jié)果為47,XY,-4,11q-,14q+,der(15),der(17),+mar1,+mar2,但M-FISH檢測結(jié)果證實為48,XY,+1,t(1;14)(p32;q31)2,+der(2),-4,+der(7),del(11)(q14)。 M-FISH在檢測過程中,不需要事先知道是否存在異常,而一次檢測
16、約2天時間,就可以檢測4份標(biāo)本,省時、省力,實現(xiàn)了核型分析自動化。因此我們認(rèn)為M-FISH在檢測ALL復(fù)雜核型異常中的應(yīng)用前景廣闊。 但是,通過本研究我們也發(fā)現(xiàn)了M-FISH技術(shù)的局限性,為此提出了一些相應(yīng)改進(jìn)要求:染色體分散要好,數(shù)量應(yīng)較多,對質(zhì)量要求高,但單個染色體可以毛糙。因此氣干法滴片時,可選用4,95%乙醇泡過的玻片,滴片時玻片與滴管的距離盡量長;M-FISH對染色體內(nèi)的改變?nèi)绫蹆?nèi)倒位,小的片段的缺失與重復(fù)檢測效果較差。對上述異常需要結(jié)合常規(guī)顯帶技術(shù)或比較基因組雜交技術(shù)來確認(rèn)。 總而言之,M-FISH技術(shù)能夠明確ALL患者的復(fù)雜核型異常,并且真正實現(xiàn)了核型分析的自動化,應(yīng)用前景廣闊,
17、它已成為精確染色體核型分析所不可缺少的先進(jìn)手段?!緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Liehr T,Srarke H,Weise A,et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol Histopathol,2004;19: 229-2372趙萌,陳冰,王璐等. 多重?zé)晒庠浑s交技術(shù)體系的建立及其在檢測白血病復(fù)雜核型異常中的應(yīng)用. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志,2002;19:375-3783Langer S,Kraus J,Jentsch I,et al. Multicolor chromosome pain- ting in diagnostic and research applications. Chromosome Res,2004;12:15-234van-Limbergen H,Poppe B,Michaux L,et al. Identification of cytogenetic subclasses and recurring chromosomal aberrations in AML and
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