急性淋巴細(xì)胞白血病化療緩解后TCRγ基因檢測的意義

1、    急性淋巴細(xì)胞白血病化療緩解后TCR基因檢測的意義          摘要目的：定量檢測急性淋巴細(xì)胞白血病化療效應(yīng)差異及其臨床意義。方法：應(yīng)用競爭性PCR技術(shù)，定量檢測急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)細(xì)胞中T細(xì)胞受體(TCR)基因重排。結(jié)果：檢測ALL患者54例158份骨髓標(biāo)本，隨訪時間中位數(shù)為33.5個月。臨床緩解時36例患者的白血病細(xì)胞<1×10-5，18例為(354±327)×10-5。誘導(dǎo)緩解期的殺傷效應(yīng)與緩解早期的殘留

2、白血病細(xì)胞數(shù)量顯著相關(guān)，并與臨床復(fù)發(fā)相關(guān)。部分患者緩解后殘留白血病細(xì)胞數(shù)量持續(xù)小于1×10-5且臨床無復(fù)發(fā)。結(jié)論：白血病化療效應(yīng)差異顯著，化療效應(yīng)的定量評價有助于制定個體化的治療方案。關(guān)鍵詞白血病，淋巴細(xì)胞性，急性殘留白血病細(xì)胞基因重排Detection of TCR gene in acute lymphoblastic leukemia after remission and its clinical significanceLiu Leyu, Sun Jinying, Yin Huijun. Pediatric Department of People's Hospit

3、al,Beijing Medical University,Beijing100044AbstractObjectives: To investigate the quantitative evaluation of chemotherapy efficiency in patients with acute leukemia and its clinical significance. Methods: Clonal rearrangement of T-cell receptor gene in ALL was detected quantitatively by using compet

4、itive PCR. Results: One hundred and fifty-eight samples were collected from 54 childhood ALL. The median follow-up duration was 33.5 months. At remission, the amount of leukemic cells in 36 cases was less than 1×10-5, and in 18, was (354±327)×10-5. The efficiency of induction therapy

5、was related significantly to the amount of the detectable residual leukemic cells in the early remission phase and to clinical relapse. In some patients in remission,the amount of leukemic cells persistently under 1×10-5 without clinical relapse. Conclusion: Quantitative evaluation of the chemo

6、therapy efficiency is helpful for individualized treatment. Key wordsLeukemia, lymphoblastic, acuteResidual leukemic cellGene rearrangement目前，大多數(shù)的小兒急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)可以通過大劑量化療而得到治愈。然而，化療的療程通常為23年，還可產(chǎn)生許多與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)，使治愈后生存質(zhì)量較低。制定個體化的化療方案可能是解決上述問題的重要途徑之一。我們試對白血病的化療效應(yīng)進(jìn)行定量評價，探討白血病個體化治療的可行性。病例和方法1患者及標(biāo)本19891996

7、年我科收治的66例兒童ALL患者。其中男41例，女25例。免疫分型T-ALL8例，早期前B-ALL和前B-ALL共58例。患者按大劑量化療方案進(jìn)行治療1。收集不同治療時期患者骨髓標(biāo)本，用常規(guī)方法提取DNA。2聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增及白血病克隆確定2取患者標(biāo)本DNA 1g按常規(guī)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。TCR基因在多數(shù)ALL細(xì)胞中呈現(xiàn)出克隆性重排。通過對TCR基因PCR產(chǎn)物的限制性內(nèi)切酶類型分析可確定白血病克隆。如果某一患者的初診標(biāo)本與緩解期標(biāo)本DNA的PCR產(chǎn)物呈現(xiàn)出一致的酶切類型，則證明患者在緩解期體內(nèi)有微量殘留白血病細(xì)胞，并進(jìn)一步進(jìn)行定量分析。3DNA序列分析及312bp缺失性競爭片段的合成我們

8、所用引物的PCR產(chǎn)物為400bp片段。在3%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上電泳分離PCR產(chǎn)物，按常規(guī)方法進(jìn)行純化，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，并用雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA序列測定，證實為TCR基因的V7-J1重排，其中含有2個限制性內(nèi)切酶Hae位點(diǎn)(序列資料省略)。經(jīng)該酶消化后可產(chǎn)生3個DNA片段(38，88和274bp)。取2l純化PCR產(chǎn)物，在20l的反應(yīng)體系中用Hae 5U在37消化1小時。取酶切產(chǎn)物5l在20l反應(yīng)體系中用T4 DNA 3U 16反應(yīng)10小時。取連接產(chǎn)物5l再次PCR擴(kuò)增。用低熔點(diǎn)膠方法回收新產(chǎn)生的312bp(38bp+274bp)缺失性競爭片段，作為內(nèi)源性競爭片段進(jìn)行競爭性PCR。分裝后在-

9、20條件下長期保存。4競爭性PCR對白血病細(xì)胞定量及檢測敏感性測定3將1g CEM細(xì)胞系(T-淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系)DNA進(jìn)行對數(shù)稀釋后，在恒定量的缺失性片段存在的情況下按上述條件進(jìn)行PCR共擴(kuò)增，并用6%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離。經(jīng)銀顯色后(Promega公司提供銀染試劑盒)可見312bp擴(kuò)增帶的吸光度隨CEM DNA加入量的減少(相應(yīng)的400bp擴(kuò)增帶的吸光度因此也減少)而逐漸增加，呈現(xiàn)出明顯的競爭關(guān)系(附)，并可見在CEM DNA被稀釋到10-5時，仍有可明確分辨出的擴(kuò)增帶。即本方法檢測殘留白血病細(xì)胞的敏感性為10-5。用像分析儀(IBAS 2000，德國)進(jìn)行PCR結(jié)果定量分析，以C

10、EM DNA加入量的對數(shù)值與400bp和312bp吸光度比值的對數(shù)值作，制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)待測患者DNA標(biāo)本在同樣的條件下同時進(jìn)行擴(kuò)增時，該標(biāo)準(zhǔn)曲線便可以用于患者標(biāo)本中白血病細(xì)胞的定量檢測。殘留白血病細(xì)胞定量的數(shù)值代表白血病細(xì)胞占有核細(xì)胞的比例。    17表示CEM DNA 1g經(jīng)1(100106)倍比稀釋后加入；M為標(biāo)志pBR322-Hae。本結(jié)果經(jīng)象及統(tǒng)計學(xué)分析后獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.319-0.133X,r=0.997,P<0.01，用于定量分析附競爭性PCR結(jié)果1白血病大劑量誘導(dǎo)緩解治療效應(yīng)的定量評價在ALL患者66例中，有54例被證實存在有

11、白血病性克隆性重排的TCR基因。這些患者治療前平均白血病細(xì)胞數(shù)占0.824。在臨床緩解時，有36例PCR檢測結(jié)果為陰性（即殘留白血病細(xì)胞數(shù)量小于1×10-5)。另18例PCR檢測為陽性，白血病細(xì)胞定量結(jié)果為(354±327)×10-5。2白血病緩解期治療效應(yīng)的定量評價54例患者在臨床完全緩解后隨訪時間的中位數(shù)為33.5個月(175個月)，在此期間共收集到158份骨髓標(biāo)本。其中有32例患者的62份緩解后不同時期骨髓標(biāo)本被檢測出殘留白血病細(xì)胞。在臨床緩解時PCR檢測為陰性的36例患者中，有14例患者在以后的隨訪中至少有1次骨髓標(biāo)本為PCR檢測陽性，其中2例臨床復(fù)發(fā)。而

12、臨床緩解時PCR檢測結(jié)果為陽性的18例患者，被隨訪的17例中均至少有1次PCR檢測陽性，其中5例患者臨床復(fù)發(fā)。臨床緩解后不同時期殘留白血病細(xì)胞定量結(jié)果見附表。在緩解后的早期，臨床緩解時PCR檢測陰性組病例的白血病細(xì)胞數(shù)量明顯低于臨床緩解時PCR檢測陽性組的病例(121±34)×10-5 vs (285±130)×10-5，P <0.001，并且具有較高的PCR檢測轉(zhuǎn)陰率和較低的復(fù)發(fā)率(P<0.01)。而對于長期臨床緩解的患者，兩組殘留白血病細(xì)胞數(shù)量無顯著差異(P>0.05)。討論白血病患者在臨床緩解后較長的一段時間內(nèi)，殘留白血病細(xì)胞的檢

13、測結(jié)果可持續(xù)為陽性。目前的研究表明，單純對殘留白血病細(xì)胞進(jìn)行定性檢測，并不能準(zhǔn)確反映患者的狀態(tài)。我們應(yīng)用競爭性PCR的原理，建立了定量檢測白血病細(xì)胞克隆性重排的TCR基因的方法，探討應(yīng)用殘留白血病細(xì)胞定量方法來指導(dǎo)白血病臨床化療的可能性。但需要指出的是，我們建立的方法僅是對TCR基因進(jìn)行定量分析，只能部分地反映出患者的殘留白血病狀態(tài)。如果能利用這樣的技術(shù)同時定量檢測其它標(biāo)志基因，如檢測ALL免疫球蛋白重鏈基因重排，將可能更為全面。附表緩解后不同時期殘留白血病細(xì)胞定性及定量檢測結(jié)果臨床緩解時PCR結(jié)果緩解后1年緩解后2年緩解后3年P(guān)CR陽性例數(shù)(總例數(shù))定量(10-5)復(fù)發(fā)例數(shù)PCR陽性例數(shù)(總

14、例數(shù))定量(10-5)復(fù)發(fā)例數(shù)PCR陽性例數(shù)(總例數(shù))定量(10-5)復(fù)發(fā)例數(shù)陰性(36例)12(32)121±3407(27)42±6618(23)19±251陽性(18例)17(17)285±13028(13)106±8135(11)32±450P值<0.001<0.001<0.01>0.05>0.05>0.05     注：顯著性檢驗P值為同列中對應(yīng)值的比較 我們的研究表明，ALL患者對白血病治療的反應(yīng)性有明顯差異。患者經(jīng)大劑量誘導(dǎo)緩解治療達(dá)到臨床緩解時

15、，66.7%的患者可獲得5個對數(shù)級的白血病殺傷效應(yīng)(殘留白血病細(xì)胞定量小于1×10-5)，而部分患者僅獲23個對數(shù)級殘留白血病細(xì)胞數(shù)為(354±327)×10-5的殺傷效應(yīng)。誘導(dǎo)緩解治療的效應(yīng)對緩解期患者體內(nèi)的殘留白血病細(xì)胞數(shù)量有明顯影響：在誘導(dǎo)緩解治療階段白血病細(xì)胞負(fù)荷消減較少(23個對數(shù)級)的患者，緩解后早期殘留白血病細(xì)胞的數(shù)量較高且有較高的復(fù)發(fā)危險性，PCR檢測轉(zhuǎn)陰率亦較低；而臨床緩解后獲得5個對數(shù)級以上殺傷效應(yīng)的患者，情況相反，甚至27.8%的患者在臨床緩解后殘留白血病細(xì)胞檢測長期持續(xù)性陰性且臨床無復(fù)發(fā)。對后者如果在臨床上仍采取較強(qiáng)的化療方案，可能會給患者

16、帶來許多不必要的不良反應(yīng)。目前認(rèn)為，大劑量化療用于ALL的主要作用是減少白血病細(xì)胞負(fù)荷量，而不能清除殘留白血病細(xì)胞4。我們的結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，緩解2年和3年的患者體內(nèi)殘留白血病細(xì)胞數(shù)無顯著的差異。然而，我們的研究還表明，如果在誘導(dǎo)緩解期白血病細(xì)胞殺傷效應(yīng)大于5個對數(shù)級，則可明顯地減少臨床緩解期殘留白血病細(xì)胞的數(shù)量，增加PCR的轉(zhuǎn)陰率及減少臨床復(fù)發(fā)的機(jī)會。因此，在白血病治療的初期，應(yīng)當(dāng)通過大劑量、密集的化療最大限度地殺傷白血病細(xì)胞，以達(dá)到5個對數(shù)級以上的殺傷效應(yīng)，而對于長期緩解的病例，如果殘留白血病細(xì)胞定量檢測的結(jié)果為持續(xù)低水平，應(yīng)避免強(qiáng)化療而選用其它療法，如免疫治療5等。由此可見，定量評價白血病細(xì)胞

17、殺傷效應(yīng)是十分有意義的。本課題受衛(wèi)生部青年（啟動）基金資助作者單位：100044北京醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院兒科參 考 文 獻(xiàn)1殷慧君. 急性淋巴細(xì)胞白血病的化學(xué)治療. 見：殷慧君 主編. 小兒急性白血病化學(xué)治療. 北京：科學(xué)出版社，1995. 55-71.2Taylor JJ, Rowe D, Williamson IK, et al. Detection of T cell receptor gamma chain V gene rearrangements using the polymerase chain reaction: application to the study of clonal di-sease cells in acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1991, 77: 1989-1995. 3Zachar V, Thomas RA, Goustin AS. Absolute quantification of target DNA: a simple competitive PCR for efficient analysis of multiple samples. Nu