當(dāng)歸補(bǔ)血湯煮出汁激活成熟T淋巴細(xì)胞胞外信號控制激酶的研究

1、當(dāng)歸補(bǔ)血湯煮出汁激活成熟T淋巴細(xì)胞胞外信號控制激酶的研究摘要: 當(dāng)歸補(bǔ)血湯（DBT）源自紫云英類和當(dāng)歸類植物根部。這種中藥煮出物已經(jīng)被證實(shí)能夠刺激T淋巴細(xì)胞增殖。然而這種激活的機(jī)理尚不得而知。在成熟T淋巴細(xì)胞中，當(dāng)歸多糖的應(yīng)用能夠顯著誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖，白細(xì)胞介素2，4，6的釋放以及胞外信號控制激酶（ERK）的磷酸化。對ERK抑制劑的預(yù)處理阻止了DBT誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。另外，DBT的多糖富集片段對成熟T淋巴細(xì)胞具有顯著作用，這表明DBT多糖在控制免疫反應(yīng)中扮演了重要角色。關(guān)鍵詞 當(dāng)歸補(bǔ)血湯，紫云英屬植物根部，當(dāng)歸類植物根部，T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞原漿移動，ERK.1 介紹在數(shù)以千計(jì)的中國傳統(tǒng)中草藥中當(dāng)歸僅由

2、兩種草藥構(gòu)成。公元1247年中國人李東玉在其著作內(nèi)外傷編獲論中第一次記載了當(dāng)歸補(bǔ)血湯。李認(rèn)為當(dāng)歸補(bǔ)血湯應(yīng)該包括以下內(nèi)容：10錢紫云英根，2錢當(dāng)歸。一錢大約相當(dāng)于3克。在傳統(tǒng)中醫(yī)里，當(dāng)歸補(bǔ)血湯是用來治療女性更年期綜合癥的。患者遵醫(yī)囑服下當(dāng)歸補(bǔ)血湯（DBT）來提升她們的“氣”（生命活力）并促進(jìn)血液循環(huán)。紫云英根作藥用已經(jīng)證實(shí)具有增強(qiáng)免疫力，保肝，抗糖尿病，陣痛，祛痰等作用。此外，當(dāng)歸因其能夠促進(jìn)血液循環(huán)常用來調(diào)節(jié)月經(jīng)不調(diào)和改善機(jī)體免疫。雖然對這兩種草藥單一的生化分析早已進(jìn)行了， 但對DBT中兩種草藥復(fù)合作用機(jī)理尚未研究，這無疑阻礙了復(fù)合中草藥發(fā)展成為抗擊疾病和機(jī)體功能失調(diào)有效手段的進(jìn)程。通過確定D

3、BT中的生化組成，我們得以確定一個最優(yōu)提取比例，有趣的是，這個比列與古代配方的比例RA：RAS=5：1是一致的。另外，在弄清了DBT中RA類衍生物：毛蕊，芒柄花素，RAS類衍生物：阿魏酸，藁本內(nèi)酯的數(shù)量后，我們得以建立DBT的標(biāo)準(zhǔn)。DBT的免疫管理（“氣”功能中的一種）是由這里決定的。之前的研究顯示DBT的使用能夠刺激T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)散，然而對這種刺激起作用的分子尚不得而知。為了揭示這種古老草藥煮出汁的作用機(jī)理，我們用DBT處理成熟的T淋巴細(xì)胞，之后分析了包括白細(xì)胞介素IL-2，4，5，6，8，10，13，巨噬細(xì)胞群落刺激因子（GM-CSF），伽馬干擾素，腫瘤壞死阿爾法因子以及胞外信號控制激酶等

4、10中細(xì)胞因子。此外我們還鑒定了DBT多糖的作用以及DBT誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放的信號通路。2 材料與方法2.1 DBT的制備與標(biāo)準(zhǔn)化我們于2002年收集來自中國陜西省的3年生黃芪植物根部和來自甘肅省的2年生的冬蟲夏草根部。將RAS和RA以5：1的比例加入并在渦流中混勻而得到DBT。將混合物與8升水共煮兩小時并提取兩次。提取的方法遵照古代配方進(jìn)行，此配方已被證實(shí)是最優(yōu)提取方法。RA與RAS的分離樣本也采用同樣的提取方法。用70%乙醇處理DBT提取物沉淀可以將DBT多糖分割成富多糖片段和貧多糖片段兩部分。在4000個g的離心加速度下離心20min即可將這兩種片段分離開來。富集多糖片段占總干重的18%。

5、將這兩種片段用凍干法干燥并在-80攝氏度下保存。DBT的標(biāo)準(zhǔn)化通過使用高效液相色譜法（HPLC）分析阿魏酸，毛蕊，芒柄花素以及藁本內(nèi)酯的含量來完成。分析純級試劑和HPLC級試劑來自德國達(dá)姆施塔特地區(qū)（Darmstadt）默克公司（Merck）。一套沃特斯（Waters）HPLC系統(tǒng)包括600臺泵，717個自動采樣器（auto-sampler），1臺紫外可見光電二極管（UV/VIS Photodiode），以及用于全程分析的2996個檢測器。色譜分離是用乙腈作為溶劑A以及0.01%磷酸作為溶劑B在DELTA-PAKC柱（粒徑為4.7微米，3.9mmx150mm）內(nèi)并在流速為1.0ml/min的流

6、動相以及室溫下進(jìn)行的。2.2 T淋巴細(xì)胞的成熟與增殖試驗(yàn)人類T淋巴細(xì)胞來自Ficou-Hypaque捐贈的新鮮健康血液細(xì)胞。純化的t淋巴細(xì)胞在RPIM-1640的環(huán)境下經(jīng)過兩次清洗再投入密度為100000個每格共有96格的成熟盤。其中有六成的t淋巴細(xì)胞是為了做XTT試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線而進(jìn)行培養(yǎng)的。成熟的t淋巴細(xì)胞分別用DBT,RA,RAS,RA與RAS的混合物以及植物凝血素（PHA）處理3天。用25微升注射器將混合的XTT溶液注入每個方格中，在含空氣95%和二氧化碳5%的飽和水溶液下經(jīng)過四小時培養(yǎng)使其成熟。在450納米條件下測量其吸光率。細(xì)胞數(shù)量由標(biāo)準(zhǔn)曲線決定。在阻礙試驗(yàn)分能夠析中，MEK抑制劑U

7、0126用二甲基亞砜溶解并于其他藥物加入前3小時加入。用TPA作為ERK激活劑。2.3 細(xì)胞素抗體試驗(yàn)與ELISA成熟t淋巴細(xì)胞不同細(xì)胞分泌物的檢測由鐳射生物（Ray Biotech）完成。簡要來說，抗體對對抗不同的細(xì)胞活素后會在人造的細(xì)胞活素試驗(yàn)器具上留下斑點(diǎn)。用DBT處理t淋巴細(xì)胞3天。在試驗(yàn)過程中持續(xù)加入100ul的條件培養(yǎng)液兩小時以測量細(xì)胞活素的分泌量。再加入共軛生物素基本抗體一小時使用GenePix professional 4200A掃描可知碎片在555nm的光波下被激活并發(fā)散出565nm的光波。使用GenePix Pro 5.0軟件分析成像，并按照之前試驗(yàn)校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為細(xì)胞活素

8、定量。t淋巴細(xì)胞分泌的IL2,IL6,IL10的量在稍后使用電子生物科學(xué)儀ELISA kit測出。再將t淋巴細(xì)胞用DBT處理3天。用100微升注射器收集每個方格中的條件培養(yǎng)液，按照協(xié)議IL2,IL6,IL10的數(shù)量測定由ELISA得制造商測定。最終經(jīng)校核后可知盤中物質(zhì)吸光率為450nm。2.4 ERK1,2磷酸化的測定 用DBT對成熟t淋巴細(xì)胞各自處理0，10，20，30，45，60min。為了分析抑制劑的作用，在加入藥劑前先讓所有成熟t淋巴細(xì)胞的血清“挨餓”3小時。在藥物處理結(jié)束后立即將細(xì)胞投入細(xì)胞溶解緩沖儀（125ml Tris-HCL,2%SDS,10%甘油，PH6.8），其中的蛋白質(zhì)使

9、用SDS-PAGE法進(jìn)行分析。在4攝氏度的條件下用抗ERK12磷酸化抗體和ERK12抗體處理12小時即可識別出已磷酸化的ERK12,免疫復(fù)合物用ECL法分析。蛋白質(zhì)的含量通常利用美國伯樂工具盒采用布拉德福方法進(jìn)行測定。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)由版本1的PREMER程序?qū)崿F(xiàn)：基本變量和控制變量的差異按學(xué)生t測試的結(jié)果進(jìn)行劃分：P<0.05較顯著,P<0.01顯著,P<0.005非常顯著。3 結(jié)果3.1 DBT校準(zhǔn)通過發(fā)現(xiàn)兩種化學(xué)標(biāo)記（毛蕊異黃酮和芒柄花）在RA的數(shù)量和另外兩種化學(xué)標(biāo)記（阿魏酸和藁本）在RAS的數(shù)量，我們能夠使最優(yōu)的DBT標(biāo)準(zhǔn)化。標(biāo)準(zhǔn)化的DBT應(yīng)當(dāng)是：每1克干DBT包含0.186

10、毫克毛蕊，0.155毫克異黃酮，0.351毫克阿魏酸和0.204毫克藁，這符合我們先前的校準(zhǔn)5,7。從提取效率的計(jì)算，我們發(fā)現(xiàn)DBT的產(chǎn)量在這個重量比為32 ± 3（n=5）。這些參數(shù)為其余生化實(shí)驗(yàn)確定化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和最佳DBT的混合物。3.2 DBT促使T淋巴細(xì)胞再生為了揭示DBT可能具有的免疫調(diào)節(jié)功能，將DBT、RA、RAS和RA + RAS的液態(tài)提取物（先各自煮沸，然后按5:1的比例混合在一起）培養(yǎng)應(yīng)用到人類T淋巴細(xì)胞，促使細(xì)胞增殖。各組都顯示對T細(xì)胞的增殖有明顯的刺激效應(yīng)（如圖1）。不同的草本精華有著不同的劑量要求。在劑量為0.1毫克/毫升，DBT的顯示出最大效應(yīng)，而且效果明顯高于

11、其他組。提取物濃度更高時就不會顯著促進(jìn)細(xì)胞的再生，這顯示了飽和效應(yīng)。 相比之下，增加RA+ RAS混合液（先各自煮沸），對T淋巴細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用則小得多。圖1:從RA,RAS以及DBT中提取物對T淋巴細(xì)胞的成熟作用.將不同劑量的DBT,RA,RAS或者RA+RAS加入待成熟的T淋巴細(xì)胞處理3天.以PHA為正面控制.用百分?jǐn)?shù)的形式表示細(xì)胞的增殖并與沒有加入上述物質(zhì)的細(xì)胞做比較.3.3 DBT促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞活素生成運(yùn)用來自于DBT、RA、RAS和RA + RAS的液態(tài)提取物，可以在3天之內(nèi)創(chuàng)造出成熟的T淋巴細(xì)胞。藥物催生的T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞活素（IL - 2和IL - 4和IL - 5和I

12、L - 6和IL - 8和IL - 10和IL - 13，GM - CSF的，干擾素- c和腫瘤壞死因子- a的藥物），是由細(xì)胞活素抗體排列所決定的。通過比較受控制的成熟細(xì)胞可以看出，IL - 2，IL - 6和IL - 8和IL - 10的釋放量明顯受到DBT的影響（如圖2A）。在四種細(xì)胞活素當(dāng)中，IL-2，IL - 6和IL - 10的顯示出相對DBT的特殊性，即不受RA，RAS或RA+RAS的誘導(dǎo)，因此它們被選來作進(jìn)一步分析。DBT的處理會引起IL-2的釋放量增加至3倍，IL - 6的釋放量增加至120倍和IL - 10的釋放量增加至20倍。有趣的是，用RA，RAS或一個簡單的RA和RA

13、S混合物進(jìn)行處理，并不能改變的細(xì)胞活素的釋放量，這表明將兩種草本提取物煮沸是必不可少的環(huán)節(jié)。IL - 4和IL - 5和IL - 13，GM - CSF，干擾素- c和TNF - a的水平不受DBT，RA，RAS和RA+RAS處理的影響。IL - 2，IL - 6和IL - 10的釋放量用酶聯(lián)免疫吸附測定法分析進(jìn)行量化。圖2B和C顯示經(jīng)DBT的處理后細(xì)胞活素的釋放量的劑量反應(yīng)曲線。3種細(xì)胞因子的反應(yīng)相當(dāng)類似，即都是在濃度為0.1mg/ml DBT時，誘導(dǎo)產(chǎn)生的釋放量最高；IL-2的最大誘導(dǎo)生成量為4倍，IL-6為20倍，而IL-10為8倍。通過對細(xì)胞活素排列分析結(jié)果進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)，酶聯(lián)免疫

14、吸附測定法分析的結(jié)果顯示了一個較低的數(shù)值，它能利用兩種不同的檢測系統(tǒng)的敏感性進(jìn)行計(jì)數(shù)。圖2 A:向細(xì)胞因子陣列中加入條件培養(yǎng)液檢測含量不同的細(xì)胞因子. B,C:采用ELISA法對條件培養(yǎng)液進(jìn)行檢測得到的細(xì)胞因子數(shù)量(白細(xì)胞介素IL-2,IL-6及IL-10).3.4 DBT誘導(dǎo)ERK磷酸化 ERK是有絲分裂原激活蛋白激酶（MAP）的一員，它在T淋巴細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮著關(guān)鍵信號的作用，ERK的激活決定于產(chǎn)生DBT的細(xì)胞。通過對磷酸化過的ERK和其他所有ERK使用抗體特效藥，我們揭示了在成熟T淋巴細(xì)胞中ERK1（44 kDa）和ERK2（42 kDa）的磷酸化過程：DBT的應(yīng)用能使這兩種磷酸化作用

15、增強(qiáng)（如圖3A和B）。DBT應(yīng)用30分鐘之后，ERK的磷酸化量最大，為先前的10倍，但對ERK的激活是短暫的，處理60分鐘后就會完全回到活性較低的水平。TPA，作為一個對照量被使用，能誘導(dǎo)ERK1 / 2的磷酸化過程更加持續(xù)，這比DBT更可靠。DBT誘導(dǎo)的ERK在30分鐘時將被先前處理的成熟細(xì)胞完全阻斷（如圖3C和D）。 為了進(jìn)一步探討DBT的免疫調(diào)節(jié)作用是否與ERK1 / 2的磷酸化有關(guān)，我們對在U0126處理之前用DBT處理過的T淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞活素釋放量進(jìn)行測試。DBT誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖過程完全被U0126阻斷（如圖4）。與此同時，由DBT誘導(dǎo)，IL - 2，IL - 6和IL - 1

16、0的釋放也被U0126預(yù)處理所阻斷（如圖4）。這些結(jié)果有力地證明，MEK抑制劑的預(yù)處理作用可以充分制止DBT對T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，這顯示了ERK在調(diào)解DBT的免疫反應(yīng)的關(guān)鍵作用。圖3: DBT誘導(dǎo)ERK磷酸化 A在加入BT之前先讓T淋巴細(xì)胞處于血清饑餓狀態(tài)3小時。用特制抗體使全部的以及被磷酸化了的ERK1/2都釋放出來。使用TPA作為正面控制。B用密度標(biāo)定法確定由A中所得的磷酸的數(shù)量。C磷酸法測定經(jīng)過A處理后的成熟T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，二甲基亞砜作為對照。D用密度標(biāo)定法確定由C所得的磷酸的量。圖4：DBT的誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)作用是借助ERK1 / 2完成的。T淋巴細(xì)胞在處理前預(yù)裝了緩沖處理（0.1

17、二甲基亞砜）或者是U0126，之后用DBT處理它3天。用XTT法檢測T淋巴細(xì)胞的增殖，用ELISA法測定細(xì)胞因子數(shù)，如圖3那樣。3.5 DBT的多糖是免疫的催化劑 為了確定DBT的內(nèi)中觸發(fā)上述免疫活性的活性成分，取兩小部分：多糖豐富（18干重）和多糖耗盡（干重的82）。多糖豐富的一小部分，當(dāng)應(yīng)用到成熟T淋巴細(xì)胞時，其免疫激活作用表現(xiàn)出明顯的增加。在濃度為50 毫克/毫升的多糖豐富的一小部分里，細(xì)胞增殖受刺激增加逾50，比多糖較少的部分高出5倍（如圖5A）。與此同時，富含多糖的部分在刺激細(xì)胞活素釋放方面顯示了更高的激活效應(yīng)。在濃度為50 毫克/毫升的多糖豐富的一小部分里，釋放出的IL-2，IL-

18、6和IL-10分別增加了4倍，20倍和6倍，分別為（如圖5B-D）。相比之下，多糖少的部分只能輕微誘導(dǎo)細(xì)胞活素釋放。 通過應(yīng)用多糖豐富的部分，成熟T淋巴細(xì)胞中的ERK1（44 kDa）和ERK2（42 kDa）的磷酸化程度均提高了（圖6A和B）。類比DBT的作用，在使用DBT多糖豐富部分30分鐘之后，ERK磷酸化量為最大誘導(dǎo)量的12倍。DBT多糖的作用也完全被用U0126預(yù)處理過的成熟細(xì)胞阻隔（如圖6C和D）。相比之下，多糖少的部分則沒有在ERK的磷酸化過程中顯示激活（圖6A和B）。DBT的信號通道類似于其多糖，并指導(dǎo)多糖在觸發(fā)免疫反應(yīng)中所發(fā)揮的作用。圖5：DBT多糖誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖以及細(xì)胞

19、因子的釋放。T淋巴細(xì)胞分別用富含多糖和不富含多糖的片段處理3天。A：用百分?jǐn)?shù)表示的細(xì)胞增殖圖，富含與不富含的比較。B-D：用ELISA法測定的在條件培養(yǎng)液內(nèi)的細(xì)胞因子的釋放圖。圖6：DBT多糖誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞中ERK的磷酸化。將T淋巴細(xì)胞分別用富含多糖片段和不富含多糖片段處理3天。A：用特定的抗體使總的和被磷酸化的ERK2/1被釋放。用TPA作為正面控制。B用密度標(biāo)定法確定由A中釋放的磷酸化的量。C用磷酸法測定A中除之前用U0126預(yù)處理過3小時之外的所有成熟T淋巴細(xì)胞。D用密度標(biāo)定法確定C中的磷酸量。4 討論 DBT，一個古老的中藥煎劑配方，其RA和RAS的重量比為5:1，相比RA或RAS或R

20、A + RAS的提取物（分開煮沸然后按5:1混合在一起），DBT在刺激成熟T淋巴細(xì)胞方面效果要好得多。與這種功能相仿，細(xì)胞活素排列分析揭示了由于受DBT刺激，一組特定細(xì)胞活素包括IL-2，IL-6和IL-10正被成熟的T淋巴細(xì)胞釋放出來；細(xì)胞活素的釋放不是單單由RA或者RAS，抑或是RA+RAS觸發(fā)的。此外，成熟T淋巴細(xì)胞中RA+RAS的刺激作用不夠，說明把這兩種草藥放在一起沸騰是必不可少的;當(dāng)然，這種DBT的制備方法長期以來一直為中醫(yī)師所推崇。除了T淋巴細(xì)胞的效用，正確的RA、RAS重量比也已在乳腺癌，巨噬細(xì)胞和成骨細(xì)胞中被證明發(fā)揮著作用。 為什么DBT需要兩種藥草在5:1的比例下一起煮沸？

21、DBT的發(fā)明者，李東垣，金代、元代（從1115至1368年）四大著名中醫(yī)之一，寫下的規(guī)定，也許這是他臨床運(yùn)用經(jīng)驗(yàn)的積累。中醫(yī)藥的理論框架是五行：金，木，水，火，土。五行代表了我們的身體各器官并且互相協(xié)作以保持身體的平衡。李東垣堅(jiān)信身體的強(qiáng)壯與脾和氣有關(guān)；而這兩者又與免疫功能相關(guān)。根據(jù)易經(jīng)（古代中國的哲學(xué)書）的記載，地球代表五這個數(shù)字。因此，李認(rèn)為，當(dāng)RA和RAS按5:1配比時，DBT應(yīng)該會對更年期的益氣養(yǎng)血有最好的效果。 兩種可能的假設(shè)可以解釋DBT這種獨(dú)特的生化功能。首先，DBT的可能含有新的化學(xué)物質(zhì)或者相比純RA或RAS提取物更大數(shù)量的活性成分，RA和RAS在一起煮沸可能提高了新化學(xué)物質(zhì)的溶解度，并且新化學(xué)物質(zhì)只溶于DBT。這些額外的化學(xué)物質(zhì)可以解釋DBT的特殊效用。