設(shè)計引物如何設(shè)計酶切位點

1、經(jīng)常有戰(zhàn)友對一些常見問題在丁香園反復(fù)問答了很多遍，所以希望園子中一些戰(zhàn)友， 特別是低分與0 分戰(zhàn)友， 能將好的帖子歸納總結(jié)了一下，并結(jié)合自己的經(jīng)驗整理， 一方面這是個學(xué)習(xí)提高的過程，另一方面也能幫助大家解決這方面的問題。同時如有不當(dāng)或不完善的地方，希望各位戰(zhàn)友不斷補充，爭取有朝一日我們能把園子里戰(zhàn)友的經(jīng)驗系統(tǒng)整理，給大家以幫助。我先把設(shè)計引物如何設(shè)計酶切位點這方面的帖子整理一下，因為昨天一下子看到三個相似問題。原帖如下：我想向你求教一個問題, 假如說我想把胰島素基因和腺病毒載體連接起來, 如何確定設(shè)計目的基因PCR時的引物呢?和相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶呢?謝謝老師能給予講解, 謝謝 整理 ： 最

2、初的時候，由于害怕設(shè)計酶切位點最后切不開，所以經(jīng)常采用最通用的方法，用T 載體克隆解決問題，但后來發(fā)現(xiàn)她也有問題，就是濃度提不上去，你需要體大量的載體來酶切，所以感到還是直接擴增好一點。但這就需要你仔細(xì)設(shè)計引物。連入質(zhì)粒中的重要目的就是進行酶切和連接，當(dāng)然首先就是在想要合成或者是進行PCR擴增出靶基因的時候在核酸的兩端接入酶切位點，酶切位點是與你的質(zhì)粒的特點相關(guān)的，可以在質(zhì)粒的圖譜說明書上找取相應(yīng)的位點，進行設(shè)計。（一）設(shè)計引物前應(yīng)做的準(zhǔn)備工作：準(zhǔn)備載體圖譜，大致準(zhǔn)備把片斷插在那個部分對片斷進行酶切分析，確定一下那些酶切位點不能用準(zhǔn)備一本所買公司的酶的商品目錄，便于查酶的各種數(shù)據(jù)及兩種酶是否可

3、以配用（二）設(shè)計引物所要考慮的問題兩個位點應(yīng)是載體上的，所連接片斷上沒有這兩個位點，且距離不能太近，往往導(dǎo)致兩個酶都切不好。因此，緊挨在一起，只能切一個，除非恰好是與上面兩個酶在一起的酶切位點。我看promega的說明書上說，最好隔四個。還有一種情況是：不能有堿基的交叉，比如AGATCTTAA，這樣的位點比較難切。 G兩個酶切點最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補），否則效果相當(dāng)于單酶切。最好使用酶切效率高的。最好使用雙酶切有共同buffer 的酶。最好使用較常用的酶（如hind3 ， bamh1， ecor1 等） ，最好使用自己實驗室有的酶，這樣可以省錢。Tm的計算，關(guān)于Tm的問題，很多

4、的戰(zhàn)友都有疑惑。其實園子里有很多的解釋了。Tm叫溶解溫度（melting temperature, Tm ） ，即是DNA雙鏈溶解所需的溫度。大家可以理解，這個溫度是由互補的DNA區(qū)域決定的，而不互補的區(qū)域?qū)NA的溶解是沒有作用的。因此，對于引物的Tm，只有和模板互補的區(qū)域?qū)m才有貢獻。計算Tm時，只計算互補的區(qū)域（除非你的酶切位點也與模板互補）。不少戰(zhàn)友設(shè)計的引物都Tm 過低，是因為他們誤把保護堿基和酶切位點都計算到Tm里了，最后的結(jié)果是導(dǎo)致了PCR反應(yīng)的諸多困難。所以，設(shè)計引物的時候，先不管 5' 端的修飾序列，把互補區(qū)的Tm控制在55 度以上（我喜歡控制在58 以上，具體根據(jù)

5、PCR的具體情況，對于困難的PCR，需要適當(dāng)提高Tm） ，再加上酶切位點和保護堿基，這樣的引物通常都是可用的，即使有小的問題，也可以挽回。Tm溫度高的引物就比較容易克服3發(fā)卡、二聚體及3' 非特異結(jié)合等問題。簡單的計算公式可以用2+4的公式。若你計算的Tm值達(dá)到了快90 ，不包括酶切位點。引物公司給你發(fā)的單子是包括酶切位點的。自己可以再估計一下。如你設(shè)計了帶酶切位點的引物，總長分別為29、 33 個堿基，去掉酶切位點和保護堿基，分別為 17、 21 個堿基。引物公司給的單子是70 多度，實際用的只有50 度，用 55度擴的結(jié)果也差不多。其它關(guān)于Tm 值的計算，有用PP5.0 進行評價的

6、，需要考慮的參數(shù)包括：basenumber、 GC%、 Tm、 hairpin 、 dimer、 false priming 、 cross dimer 。退一般退火溫度為Tm-5度，退火溫度的計算可以不把加入的酶切位點及保護堿基考慮進去，如上所言，PCR幾個循環(huán)后，引物外側(cè)的序列已經(jīng)參入了擴增片斷中，所以你可以在預(yù)變性后多加幾步，溫度比你Tm值低些（這樣可能會增加非特異性），Tm值是你包括酶切位點及保護堿基的Primer 計算出來的。1. 一般在 5' 端加保護堿基 , 如果你擴增后把目的條帶做膠回收轉(zhuǎn)入T-VECTOR或者其它的載體的話, 酶切時可以不需加保護堿基2. 有人的經(jīng)驗加

7、入酶切位點的引物可以和未加入時使用相同的退火溫度, 結(jié)果也還是令人滿意。關(guān)于引物二聚體，最好用primer 或是其他設(shè)計引物的軟件進行計算一下，看看引物之間的G（自由能）的絕對值，如果小于10，一般是問題的。如果稍大，PCR時可以提高一下退火溫度，一般是沒有問題的。如果3端形成二聚體，并且自由能絕對值較大，如果PCR沒有條帶，建議重新設(shè)計引物。此外，所加的三個核苷酸的保護序列經(jīng)過盡心設(shè)計有時也可以降低二聚體的G。在設(shè)計酶切位點時，最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。這是因為，一個特異性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位點序列和保護性堿基，大致就是28bp左右了。 而我們在設(shè)計退火溫度時，與

8、引物的長度有關(guān)，比正常的引物(20bp) 的Tm 肯定要高一些。如果我們能利用引物自身的部分序列，就可以有效地減少引物的長度。還有，有些酶是離不開末端序列的，因此，在設(shè)計一個酶位點時，最好把該酶的性質(zhì)弄清楚設(shè)計時限制性酶切位點是應(yīng)該在5端的頂端。在設(shè)計引物時，常在5端添加酶切位點，以利于PCR產(chǎn)物連接到載體。設(shè)計引物時保證在最后5 個核苷中含有3 個 A或 T。 先用軟件設(shè)計出合適的引物，引物的3端是引發(fā)延伸的起點，因此一定要與模板準(zhǔn)確配對，應(yīng)盡量避免在引物 3端的第一位堿基是A。 (容易錯配)引物3端最佳堿基的選擇是G和 C，因為他們形成的堿基配對比較穩(wěn)定。目的序列上并不存在的附加序列，如限

9、制位點和啟動子序列，可以加入到引物5' 端而不影響特異性。當(dāng)計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應(yīng)該對其進行互補性和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的檢測。酶切位點都需要保護堿基以利于內(nèi)切酶的有效切割。酶切位點前加保護堿基1 ，兩個酶切點至少隔上3 個堿基， 在做載體構(gòu)建的時候設(shè)計引物擴增片段進行定向連接， 除了酶切位點，還要在兩端加一個三個核苷酸的保護序列，否則PCR產(chǎn)物很難被酶切，因此就會導(dǎo)致連接失敗，因為內(nèi)切酶需要一定的輔助性堿基才能順利切割，在沒有輔助堿基的情況下，有的酶是可以切割的，比如：SalI 和 SpeI，他們不需要輔助性堿基即可切割，但大部分酶是需要輔助性堿基的。所以引物順序應(yīng)是：5保

10、護堿基+酶切位點+引物配對區(qū)3下面是幾個戰(zhàn)友的討論，請問：在引物的5端加限制酶切位點，只在酶切位點的 5端加保護堿基可以嗎？還是必須要在酶切位點的兩側(cè)加保護堿基？是的，只要在5端加保護堿基可以了。其實保護堿基就是要給限制性內(nèi)切酶一個結(jié)合位點，3端還有更長的引物序列在，當(dāng)然不需要再加保護堿基了，下面就來討論一下這個問題：（下面引自NEB網(wǎng)站）1、寡核苷酸近末端位點的酶切為了解不同內(nèi)切酶對識別位點以外最少保護堿基數(shù)目的要求，NEB采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進行實驗。（這里用的是寡核苷酸！而不是末端帶酶切位點的肽鏈?。嶒灲Y(jié)果對于確定雙酶切順序?qū)袔椭ū热缭诙嘟宇^上切割位

11、點很接近時），或者當(dāng)切割位點靠近DNA末端時也很有用。然后NEB就提供了一個表，關(guān)于鏈長和切割效率的。我覺得這只能說明酶在作用于識別位點時所需占據(jù)的鏈長，并不能說明在設(shè)計酶切位點時要加那么長的保護堿基，比如我用的NotI ，要加 10 個堿基，切25個小時才95的效率，這還是用了 20 倍的酶量！我?guī)熃阒患恿? 個堿基，也沒見出現(xiàn)問題。2、線性載體近末端位點的酶切將線性載體與相應(yīng)內(nèi)切酶（10 units/ g）在適宜溫度及緩沖液條件下反應(yīng)60分鐘， 隨后進行連接和轉(zhuǎn)化。切割效率=100%-（酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化子數(shù)/再連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化子數(shù) ）"" 近末端堿基對數(shù)" 指的是從識

12、別位點到DNA末端的堿基對數(shù)，但并不包括最初切割位點處留下的單鏈突出堿基。（解釋一下：就像下面這個例子EcoRI酶切位點NNNG AATTCNNC TTAAG它的近末端堿基對數(shù)就是3，而不是4）還沒有證據(jù)表明單鏈核苷酸能否提高切割效率，因此在設(shè)計PCR引物時應(yīng)至少加上 4 個額外堿基。Not I 7 100 （2） Bluescript SK- Spe I4 100 （1） Bluescript SK-Ksp I1 98 （2） Bluescript SK Xba I拿 NotI 為例，我覺得NEB給出的這個表的意思是，用Spe I 切 Bluescript SK載體，得到帶7 個近末端堿基對

13、的NotI 酶切位點，切1 小時，效率是100，以次類推。也就是說只有帶4 個末端堿基就能達(dá)到100的效率，而不是像1 所說的要加10 個堿基，切25 個小時。因為那是針對寡核苷酸的。這是我的理解，歡迎大家討論。因為我發(fā)現(xiàn)很多人都是依據(jù)那個表來加保護堿基，不管是求助還是應(yīng)助別人。然后在5端直接加上所需的限制性酶切位點而無需考慮引入的位點和模板的互補配對情況另外保護堿基是不是也不需要與模板對應(yīng)位置配對以前討論過這個問題，其實保護堿基的問題可以歸納為幾條：1)大多數(shù)常用酶，根據(jù)NEB公司切割線性化的雙鏈DNA片段的實驗數(shù)據(jù)添加，2)某些比較常用的酶，根據(jù)NEB公司雙酶先后切割的實驗數(shù)據(jù)解決，參考的

14、文件是NEB公司提供的，見附件3)有些人隨意添加3-6 個堿基，也是一種做法，我不太贊同，畢竟不同的酶對保護堿基的要求差別很大4)最通用的方法，用T 載體克隆解決問題1。由于內(nèi)切酶在識別位點時要求位點的兩側(cè)都有幾個堿基，設(shè)計引物的時候，要在位點的外側(cè)至少再加幾個堿基？比如 3 個堿基酶切位點引物。2。進行PCR時，是不是要先在較低的溫度下反應(yīng)幾個循環(huán)，就是以不含酶切位點時引物的Tm 10 度，然后再在較高溫度做，把引物、酶切位點、額外加入的堿基都包括在內(nèi)，得到的Tm 10 度。退火溫度通常都是不考慮加入的酶切位點及保護堿基的，但要考慮發(fā)卡結(jié)構(gòu)，及錯誤引發(fā)率之類的這一段時間為了換載體，重新設(shè)計引

15、物花了不少工夫，學(xué)了不少東西，希望能和你共勉：1. 上下游引物前端個加一個限制性核酸內(nèi)切酶位點，加保護堿基并不是你所說的“內(nèi)切酶在識別位點時要求位點的兩側(cè)都有幾個堿基”，只要求在引物5端加保護堿基；如你需要在上游引物上加BamH (5-GAAGCC-)酶切位點，那么你 3的保護堿基可以為C、 CG或CGC，選擇哪一個根據(jù)你的需要，是否影響Primer的 Tm值。關(guān)于保護堿基的問題，你可以查new England 的相關(guān)資料。Linearized vectors were incubated with the indicated enzymes (10units/ g) for 60 minut

16、es at the recommended incubation temperature an dNEBuffer for each enzyme. Following ligation and transformation, cleavage efficiencies were determined by dividing the number of transformants from the digestion reaction by the number obtained from religation of the linearized DNA (typically 100-500

17、colonies) and subtracting from 100%. "Base Pairs from End" refers to the number of double-stranded base pairs between the recognition site and the terminus of the fragment; this number does not include the single-stranded overhang from the initial cut. Since it has not been demonstrated wh

18、ether these single-stranded nucleotides contribute to cleavage efficiency, 4 bases should be added to the indicated numbers when designing PCR primers. Average efficiencies were rounded to the nearest whole number; experimental variation was typically within 10%. The numbers in parentheses refer to

19、the number of independent trials for each enzyme tested (from Moreira, R. and Noren, C. (1995), Biotechniques, 19, 56-59).Note: As a general rule, enzymes not listed below require 6 bases pairs on either side of their recognition site to cleave efficiently.EnzymeBase pairsfrom End%CleavageEfficiency

20、VectorInitial CutAat II388 (2)LITMUS 29Nco I2100 (2)LITMUS 28Nco I195 (2)LITMUS 29PinA IAcc65 I299 (2)LITMUS 29Spe I175 (3)pNEB193Sac IAfl II113 (2)LITMUS 29Stu IAge I1100 (1)LITMUS 29Xba I1100 (2)LITMUS 29Aat IIApa I2100 (1)LITMUS 38Spe IAsc I197 (2)pNEB193BamH IAvr II1100 (2)LITMUS 29Sac IBamH I19

21、7 (2)LITMUS 29Hind IIIBgl II3100 (2)LITMUS 29Nsi IBsiW I2100 (2)LITMUS 29BssH IIBspE I2100 (1)LITMUS 39BsrG I18 (2)LITMUS 38BsrG IBsrG I299 (2)LITMUS 39Sph I188 (2)LITMUS 38BspE IBssH II2100 (2)LITMUS 29BsiW IEag I2100 (2)LITMUS 39Nhe IEcoR I1100 (1)LITMUS 29Xho I188 (1)LITMUS 29Pst I1100 (1)LITMUS

22、39Nhe IEcoR V1100 (2)LITMUS 29Pst IHind III390 (2)LITMUS 29Nco I291 (2)LITMUS 28Nco I10 (2)LITMUS 29BamH IKas I297 (1)LITMUS 38NgoM IV193 (1)LITMUS 38Hind IIIKpn I2100 (2)LITMUS 29Spe I2100 (2)LITMUS 29Sac I199 (2)pNEB193Sac IMlu I299 (2)LITMUS 39Eag IMun I2100 (1)LITMUS 39NgoM IVNco I2100 (1)LITMUS

23、 28Hind IIINgoM IV2100 (1)LITMUS 39Mun INhe I1100 (1)LITMUS 39EcoR I282 (1)LITMUS 39Eag INot I7100 (2)Bluescript SK-Spe I4100 (1)Bluescript SK-Ksp I198 (2)Bluescript SK-Xba INsi I3100 (2)LITMUS 29BssH II377 (4)LITMUS 29Bgl II295 (2)LITMUS 28BssH IIPac I176 (3)pNEB193BamH IPme I194 (2)pNEB193Pst IPst

24、 I398 (1)LITMUS 29EcoR V250 (5)LITMUS 39Hind III137 (3)LITMUS 29EcoR ISac I199 (2)LITMUS 29Avr IISal I389 (2)LITMUS 39Spe I223 (2)LITMUS 39Sph I161 (3)LITMUS 38Sph ISpe I2100 (2)LITMUS 29Acc65 I2100 (2)LITMUS 29Kpn ISph I299 (1)LITMUS 39Sal I297 (1)LITMUS 39BsrG I192 (2)LITMUS 38Sal IXba I199 (2)LIT

25、MUS 29Age I194 (1)LITMUS 29PinA IXho I197 (2)LITMUS 29EcoR IXma I298 (1)pNEB193Asc I292 (1)pNEB193BssH II寡核苷酸近末端位點的酶切為了解不同內(nèi)切酶對識別位點以外最少保護堿基數(shù)目的要求，NEB采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進行實驗。實驗結(jié)果對于確定雙酶切順序?qū)袔椭ū热缭诙嘟宇^上切割位點很接近時）， 或者當(dāng)切割位點靠近DNA末端時也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通常需在識別位點兩端至少加上6個保護堿基，以確保酶切反應(yīng)的進行。實驗方法：用 - 32PATP在 T4 多聚

26、核苷酸激酶的作用下標(biāo)記0.1A260單位的寡核苷酸。取1 g 已標(biāo)記了的寡核苷酸與20 單位的內(nèi)切酶，在20°C 條件下分別反應(yīng) 2 小時和 20 小時。反應(yīng)緩沖液含70 mM Tris-HCl （pH 7.6）, 10 mM MgCl 2 ,5 mMD TT及適量的NaCl或 KCl（視酶的具體要求而定）。 20%的 PAGE（ 7 M尿素）凝膠電泳分析，經(jīng)放射自顯影確定酶切百分率。本實驗采用自連接的寡核苷酸作為對照。若底物有較長的回文結(jié)構(gòu)，切割效率則可能因為出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而降低酶寡核苷酸序列鏈長切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGACC800CGGTCGACCG1000C

27、CGGTCGACCGG1200Afl IIICACATGGT800CCACATGGTG10>90>90CCCACATGGTGG12>90>90Asc IGGCGCGCCAGGCGCGTC CTTGGCGCGACAC81012>90>90>90>90>90>90Ava ICCCCGGGG850>90CCCCCGGGGG10>90>90TCCCCCGGGGGA12>90>90BamH ICGGATCGC81025CGGGATCCCG10>90>90CGCGGATCGCCG12>90>9

28、0Bgl IICAGATCGT800GAAGATCTTC1075>90GGAGATCTTCC1225>90BssH IIGGCGCGCC800AGGCGCGCCT1000TTGGCGCGCCAA1250>90BstE IIGGGT(A/T)ACCC9010BstX IAACTGCAGCACAAATGCATTGG2200AAAACTGCCACGAATGCATTAGAG242550CTGCAGACACAATGCATTAGTGGCAT2725>90Cla ICATCGAGT800GATCGACT800CCATCGAGTG10>90>90CCCATCGAGTGG12

29、5050EcoR IGGAATTC8>90>90CGGAATTCG10>90>90CCGGAATTCGG12>90>90Hae IIIGGGGCCCCAGCGGCGCCTTTGCGGCGCCAA81012>90>90>90>90>90>90Hind IIICAAGCTGT800CCAAGCTGTG1000CCCAAGCTGTGG121075Kpn IGGGTACCC800GGGGTACCCC10>90>90CGGGTACCCCG12>90>90Mlu IGACGCGCT800CGACGCGCTG10

30、2550Nco ICCCATGGG800CATGCCATGCGATG145075Nde ICCATATG800CCCATATGG1000CGCATATGCG1200GGGTTCTATATAGAACCC1800GGAATTCCATATGAATTCC2075>90GGGAATTCCATATGAATTCCC2275>90Nhe IGGCTAGCC800CGGCTAGCCG101025CTAGCTAGTCAG121050Not ITTGCGGCCAGAC1200ATTTGCGGCCTGTCTA161010AAATAGTCGGCCTGACTAAA201010ATAAGAAGTCGGCCTGACAACTAT242590AAGGAAAAGAACGGCCAGACAAGGAAAA2825>90Nsi ITGCATGCAGTCA1210>90CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT22>90>90Pac ITTAATTAA800GTTAATTACA10025CCTTAATTAGAG120>9