搖瓶種子的制備及菌種的保藏2ppt課件

1、主題二主題二 搖瓶種子的制備及菌種搖瓶種子的制備及菌種的保藏的保藏帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種顯微觀察裝置顯微觀察裝置 第三節(jié) 搖瓶種子的制備 將斜面種子或米孢子接種入裝在錐形搖瓶(又稱三角搖瓶)內(nèi)的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在搖床上振蕩培養(yǎng)得到的液體種子，就叫做搖瓶種子。 搖瓶種子可以在搖瓶中傳代，第一代俗稱“母瓶”，第二代就叫做“子瓶”。 母瓶或子瓶可用于生產(chǎn)上種子罐的接種，也常常作為搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)的種子。1.搖瓶種子的制備工藝搖瓶種子的制備工藝 (1)工藝流程 搖瓶種子的制備流程如圖5l所示。 斜面種子或米孢子 培養(yǎng)基配制 分裝 滅菌 接種 恒溫振蕩培養(yǎng) 搖瓶種子 圖51

2、搖瓶種子制備的工藝流程 （2培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基配制 搖瓶種子以培養(yǎng)具有強(qiáng)生長活性的營養(yǎng)菌體為目的，因搖瓶種子以培養(yǎng)具有強(qiáng)生長活性的營養(yǎng)菌體為目的，因而在配制培養(yǎng)基時(shí)必須全面、均衡地滿足菌體生長對(duì)各種營而在配制培養(yǎng)基時(shí)必須全面、均衡地滿足菌體生長對(duì)各種營養(yǎng)物質(zhì)的要求，包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子等。養(yǎng)物質(zhì)的要求，包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子等。 搖瓶種子在培養(yǎng)過程中一般不便于調(diào)節(jié)搖瓶種子在培養(yǎng)過程中一般不便于調(diào)節(jié)pH，故在培養(yǎng)基成分，故在培養(yǎng)基成分的選擇時(shí)還應(yīng)考慮培養(yǎng)過程中的選擇時(shí)還應(yīng)考慮培養(yǎng)過程中pH的穩(wěn)定，可以通過生理酸、的穩(wěn)定，可以通過生理酸、堿性物質(zhì)的平衡搭配及加入磷酸鹽、碳酸鈣之

3、類緩沖劑來實(shí)堿性物質(zhì)的平衡搭配及加入磷酸鹽、碳酸鈣之類緩沖劑來實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)。 分裝培養(yǎng)基的三角搖瓶用棉塞或泡沫塑料塞口，置高壓蒸汽分裝培養(yǎng)基的三角搖瓶用棉塞或泡沫塑料塞口，置高壓蒸汽鍋內(nèi)滅菌。鍋內(nèi)滅菌。 滅菌結(jié)束后要緩慢降壓，以免培養(yǎng)基暴沸沖濕塞子。滅菌結(jié)束后要緩慢降壓，以免培養(yǎng)基暴沸沖濕塞子。 (3)接種接種 搖瓶種子的接種一般采用斜面種子挖塊法搖瓶種子的接種一般采用斜面種子挖塊法或米孢子粒計(jì)數(shù)接人法?；蛎祖咦恿Ｓ?jì)數(shù)接人法。 這種接種法難于掌握一致的接種量，可能影這種接種法難于掌握一致的接種量，可能影響搖瓶種子質(zhì)量的穩(wěn)定。響搖瓶種子質(zhì)量的穩(wěn)定。 對(duì)接種量敏感的菌種，最好采用懸液接種法，對(duì)接種量敏

4、感的菌種，最好采用懸液接種法，即用無茵蒸餾水將斜面種子或米孢子粒上的細(xì)即用無茵蒸餾水將斜面種子或米孢子粒上的細(xì)胞或孢子洗下，制成細(xì)胞或抱子懸液，然后按胞或孢子洗下，制成細(xì)胞或抱子懸液，然后按一定體積或一定細(xì)胞一定體積或一定細(xì)胞(孢子孢子)數(shù)接種至搖瓶種子數(shù)接種至搖瓶種子培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中。 (4)培養(yǎng)培養(yǎng) 搖瓶種子在恒溫室內(nèi)的搖床上進(jìn)行培養(yǎng)。搖瓶種子在恒溫室內(nèi)的搖床上進(jìn)行培養(yǎng)。搖床分旋轉(zhuǎn)式和往復(fù)式兩種。搖床分旋轉(zhuǎn)式和往復(fù)式兩種。 抗生素工廠常用的是旋轉(zhuǎn)式?？股毓S常用的是旋轉(zhuǎn)式。 這種搖床由于主動(dòng)軸和從動(dòng)軸之間有一個(gè)偏這種搖床由于主動(dòng)軸和從動(dòng)軸之間有一個(gè)偏心距心距(一般為一般為2550mm)

5、，從向而旋轉(zhuǎn)中產(chǎn)生，從向而旋轉(zhuǎn)中產(chǎn)生振蕩作用，以利于培養(yǎng)時(shí)氣體交換。振蕩作用，以利于培養(yǎng)時(shí)氣體交換。 為了使搖瓶中的水分蒸發(fā)量保持穩(wěn)定，恒溫為了使搖瓶中的水分蒸發(fā)量保持穩(wěn)定，恒溫室也應(yīng)控制一定的濕度。室也應(yīng)控制一定的濕度。(5)保管保管 搖瓶種子應(yīng)當(dāng)在培養(yǎng)成熟后立即使用。搖瓶種子應(yīng)當(dāng)在培養(yǎng)成熟后立即使用。如果暫時(shí)不用，可置如果暫時(shí)不用，可置4冰箱中保存，保冰箱中保存，保存期最好不超過存期最好不超過3d。 經(jīng)過保存的搖瓶種子一般不用做生產(chǎn)種經(jīng)過保存的搖瓶種子一般不用做生產(chǎn)種子，可用于搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)或小型發(fā)酵罐子，可用于搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)或小型發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)。2搖瓶種子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)搖瓶種子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 搖瓶

6、種子是液體培養(yǎng)的種子，在質(zhì)量的搖瓶種子是液體培養(yǎng)的種子，在質(zhì)量的控制方面，除了保證不污染雜菌及生產(chǎn)控制方面，除了保證不污染雜菌及生產(chǎn)能力高這類與固體培養(yǎng)種子相同的一般能力高這類與固體培養(yǎng)種子相同的一般標(biāo)準(zhǔn)外，還有其特殊標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)外，還有其特殊標(biāo)準(zhǔn)。 (1)(1)菌體濃度菌體濃度 (2)(2)菌體生長階段菌體生長階段(1)菌體濃度菌體濃度 搖瓶種子以培養(yǎng)強(qiáng)生命力的營養(yǎng)菌體為目的，因而優(yōu)良的搖瓶種子，首先要有一定的活菌體量。 在一定的體積接種之下，活菌量越多，意味著至下一級(jí)種子的接種量越大，下一級(jí)種子的生長就越快，生長質(zhì)量一般也越好。 菌體濃度也不能太高，否則將影響搖瓶中的混合和氣體交換，降低菌體

7、生長質(zhì)量。（2菌體生長階段菌體生長階段 為了使搖瓶種子有較強(qiáng)的生長活力，同時(shí)又滿足上述達(dá)到較高菌體濃度的要求，應(yīng)將搖瓶種子的菌體生長階段控制在對(duì)數(shù)生長的后期。 這一菌體生長階段，本應(yīng)由測(cè)得的菌體濃度變化曲線來確定，但搖瓶系統(tǒng)取樣監(jiān)測(cè)不現(xiàn)實(shí)，且測(cè)量結(jié)果滯后，通常只憑在一定培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)外觀稠度的觀察、靜置沉降量或離心濕菌體積的測(cè)定以及顯微鏡檢查的結(jié)果進(jìn)行判斷。3.影響搖瓶種子質(zhì)量的因素及其控制影響搖瓶種子質(zhì)量的因素及其控制 影響斜面種子質(zhì)量的各種因素一般也影響搖瓶種子的質(zhì)量。除此以外，還有以下一些因素必須予以注意。 （1培養(yǎng)基組成 （2搖瓶裝量 （3搖床轉(zhuǎn)速 （4搖瓶在搖床中的位置 （1培養(yǎng)基組成培

8、養(yǎng)基組成 培養(yǎng)基組成應(yīng)能均衡地滿足營養(yǎng)菌體生長對(duì)所有營養(yǎng)成分的需要。 在這一前提下，培養(yǎng)基組成越豐富，所能獲得的菌體濃度就越高。 如果由于某一必需營養(yǎng)成分不足而打破了這種均衡，那么其它營養(yǎng)成分的豐富不僅不能促進(jìn)菌體的生長，反而因代謝的失衡引起pH的波動(dòng)或(和)毒性中間代謝產(chǎn)物的積累，而降低菌體濃度。（2搖瓶裝量搖瓶裝量 搖瓶裝量影響搖瓶?jī)?nèi)的通氣效果；裝量越小，通氣效果越好。 對(duì)搖瓶種子培養(yǎng)最合適的裝量，隨抗生素產(chǎn)生菌耗氧特性和搖床轉(zhuǎn)速而異，應(yīng)當(dāng)通過實(shí)驗(yàn)來確定。 一般情況下，250、500mL和750mL搖瓶的裝量分別為4050、6080mL和80100mL，基本上可以滿足各種抗生素?fù)u瓶種子培養(yǎng)

9、的要求。（3搖床轉(zhuǎn)速搖床轉(zhuǎn)速 搖床轉(zhuǎn)速越高，偏心距越大，搖瓶?jī)?nèi)的氣體交換速度就越快。 我國設(shè)計(jì)的搖床，一般偏心距為25mm，轉(zhuǎn)速為200300rmin。 但在使用中應(yīng)經(jīng)常檢查傳動(dòng)皮帶的松緊，皮帶過松將使轉(zhuǎn)速顯著下降，從而影響搖瓶通氣效果的搖瓶種子的培養(yǎng)。（4搖瓶在搖床中的位置搖瓶在搖床中的位置 由于代謝熱和機(jī)械振蕩熱的生成，搖床瓶?jī)?nèi)的溫度必由于代謝熱和機(jī)械振蕩熱的生成，搖床瓶?jī)?nèi)的溫度必然高于搖床室室溫。然高于搖床室室溫。 在搖床的不同位置，這種溫差存在明顯的差異。搖床在搖床的不同位置，這種溫差存在明顯的差異。搖床上層的溫度高于下層，中間的溫度高于邊緣。上層的溫度高于下層，中間的溫度高于邊緣。

10、由于這種差異，使在不同位置上培養(yǎng)的搖瓶種子呈現(xiàn)由于這種差異，使在不同位置上培養(yǎng)的搖瓶種子呈現(xiàn)不同的菌體生長濃度和生長階段，造成種子質(zhì)量的波不同的菌體生長濃度和生長階段，造成種子質(zhì)量的波動(dòng)。動(dòng)。 為了避免這種波動(dòng)，搖瓶種子的培養(yǎng)最好在具有相同為了避免這種波動(dòng)，搖瓶種子的培養(yǎng)最好在具有相同溫度帶的搖床固定位置上進(jìn)行。溫度帶的搖床固定位置上進(jìn)行。4孢子接入量孢子接入量 對(duì)于絲狀菌來說，孢子接入量對(duì)搖瓶種子的質(zhì)量及其對(duì)于絲狀菌來說，孢子接入量對(duì)搖瓶種子的質(zhì)量及其后的抗生素生產(chǎn)有很大的影響。后的抗生素生產(chǎn)有很大的影響。 接入孢子量過少，延緩種子的生長及發(fā)酵前期的產(chǎn)物接入孢子量過少，延緩種子的生長及發(fā)酵前

11、期的產(chǎn)物合成；合成； 接入孢子量過大，能加速種子的生長和發(fā)酵前期產(chǎn)物接入孢子量過大，能加速種子的生長和發(fā)酵前期產(chǎn)物合成的速度，但后期產(chǎn)物合成速度下降較快。合成的速度，但后期產(chǎn)物合成速度下降較快。 究竟采用多大的孢子接種量比較合適，對(duì)于每種抗生究竟采用多大的孢子接種量比較合適，對(duì)于每種抗生素的生產(chǎn)都應(yīng)當(dāng)通過實(shí)驗(yàn)來確定。素的生產(chǎn)都應(yīng)當(dāng)通過實(shí)驗(yàn)來確定。第四節(jié)第四節(jié) 菌種保藏菌種保藏 在生產(chǎn)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的某一代謝產(chǎn)物能力的微生物菌種的保存和長期保藏，對(duì)于一成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件的條件(1)(1) 經(jīng)長期保藏后菌種存活

12、健在；經(jīng)長期保藏后菌種存活健在；(2) (2) 保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的是不改變初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。高產(chǎn)能力。(3)(3)菌種保藏的基本措施是低溫、枯燥、真空。菌種保藏的基本措施是低溫、枯燥、真空。二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù) (1)冷凍干燥或真空干燥保藏； (2)超低溫或在液氮中冷凍保藏； (3) 轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?(4)土壤或陶瓷珠等載體干燥保藏。( (一一) ) 冷凍保藏冷凍保藏 冷凍保藏為最簡(jiǎn)單而有效的方法。冷凍保藏為最簡(jiǎn)單而有效的方法。 通

13、過冷凍，使微生物代謝活動(dòng)停止。通過冷凍，使微生物代謝活動(dòng)停止。 一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。 為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護(hù)劑。定的冷凍保護(hù)劑。 冷凍保藏時(shí)溫度要求在冷凍保藏時(shí)溫度要求在-20-20以下，同時(shí)應(yīng)認(rèn)真掌握好以下，同時(shí)應(yīng)認(rèn)真掌握好冷凍速度和解凍速變。冷凍速度和解凍速變。 冷凍深藏的缺點(diǎn)之一是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。冷凍深藏的缺點(diǎn)之一是培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難。冷凍保藏種類冷凍保藏種類 一、普通冷凍保藏技術(shù)一、普通冷凍保藏技術(shù)(-20)(-20)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)二、超低溫冷凍保藏

14、技術(shù)(-60 (-60 一一 -80)-80)三、液氮冷凍保藏技術(shù)三、液氮冷凍保藏技術(shù) 1.1.普通冷凍保藏技術(shù)普通冷凍保藏技術(shù)(-20)(-20) 將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細(xì)胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在或于溫度范圍在-5-5-20-20的普通冰箱的普通冰箱(-20)(-20)中。中?；蛘撸瑢⒕N培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待或者，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，同生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)格封好，同上

15、置于冰箱中保存。上置于冰箱中保存。 用此方法可以維持若干微生物的活力用此方法可以維持若干微生物的活力1 12 2年。年。 應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。用來保藏。 保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴(yán)格密封。管應(yīng)嚴(yán)格密封。 這一方法雖簡(jiǎn)便易行，但不適宜多數(shù)微生物的這一方法雖簡(jiǎn)便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。長期保藏。2.2.超低溫冷凍保藏技術(shù)超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60(-60-80)-80) 要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60-60

16、以下進(jìn)行以下進(jìn)行保藏。保藏。 在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是： (1)(1)離心收獲對(duì)數(shù)生長中期至后期的微生物細(xì)胞；離心收獲對(duì)數(shù)生長中期至后期的微生物細(xì)胞； (2)(2)用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞；用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細(xì)胞； (3)(3)加入等體積的加入等體積的2020甘油或甘油或1010二甲亞砜；二甲亞砜； (4)(4)混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70-70超低溫冰超低溫冰箱中保藏。箱中保藏。 如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含1010甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗

17、滌收獲。甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。 超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1 1 22minmin。 若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏若干細(xì)菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5 5年而活力不受影響。年而活力不受影響。3.3.液氮冷凍保藏技術(shù)液氮冷凍保藏技術(shù) (1)冷凍保護(hù)劑 在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10、二甲亞砜5。 所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。 (2)(2)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟 冷凍保藏菌種懸液的制備冷凍保藏菌種懸液的制備 a.a.從生長斜面制

18、備菌懸液：從生長斜面制備菌懸液： 每一斜面加入每一斜面加入5ml5ml含含1010甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)基；甘油的營養(yǎng)液體培養(yǎng)基；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；0.50.5lmllml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶， b.從浸沒培養(yǎng)物制備菌懸液： 在浸沒培養(yǎng)液中加入等體積20%無菌甘油；輕輕振蕩混勻培養(yǎng)液，如果菌體絮凝較緊，則需先用玻璃珠打散； 0.5 lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口； 將所有封好的安瓿置于5冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培養(yǎng)基之間達(dá)到平衡。 控速冷凍a.將安瓿

19、或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；b.將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中；c.以1 2/min的致冷速度降溫，直到溫度達(dá)到相對(duì)溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30)；d.補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時(shí)盡可能快地發(fā)生相變；e.e.細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1/min1/min，直到，直到溫度達(dá)溫度達(dá)-50-50；f.f.將安瓿迅速移入液氮罐中于液相將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196)(-196)或或 氣相氣相(-156)(-156)中保存。中保存。 如果無控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶如果無控速冷凍機(jī)，則一般可將安瓿或液氮瓶置

20、于一置于一7070冰箱中冷凍冰箱中冷凍4h4h，然后迅速移入液氮，然后迅速移入液氮罐中保存。罐中保存。復(fù)蘇 a從液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；b迅速將安瓿置于37 40水浴中，并輕輕搖動(dòng)以加速解；c用巴氏吸管將安瓿中貯存培養(yǎng)物移接入含有2m1無菌液體培養(yǎng)基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1 0.2ml (約4、8滴)轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。4. 4. 凍干保藏凍干保藏 冷凍干燥的基本方法：是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培養(yǎng)物干燥。 此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一。 冷凍干燥過程中必須使用冷凍保護(hù)劑，目前國內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國外尚有運(yùn)用動(dòng)物血

21、清等的。 大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。 而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)行冷凍保藏，便于運(yùn)輸。培養(yǎng)物的凍干過程培養(yǎng)物的凍干過程(1)(1)操作步驟操作步驟啟動(dòng)冷凍干燥器的致冷單元。當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到啟動(dòng)冷凍干燥器的致冷單元。當(dāng)冷凝器的溫度達(dá)到-40-40時(shí)時(shí)啟動(dòng)真空泵，使真空度達(dá)到啟動(dòng)真空泵，使真空度達(dá)到2.672.674.00Pa4.00Pa。將冷凍槽置于歧管之下方。槽中裝入將冷凍槽置于歧管之下方。槽中裝入2 23 3體積的異丙醇，體積的異丙醇，然后插入溫度計(jì)及可調(diào)溫控儀降溫探頭。然后插入溫度計(jì)及可調(diào)溫控儀降溫探頭。 打開降溫探頭控制醇浴溫度在打開降溫探頭控制醇浴溫度

22、在-40-40，這一過程約需，這一過程約需30min30min。每支斜面加入每支斜面加入2ml 202ml 20的脫脂乳，然后用巴氏吸管將斜面的脫脂乳，然后用巴氏吸管將斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌體均懸液，最終菌株濃度一上的菌苔吹打下制成孢子或菌體均懸液，最終菌株濃度一般要求在般要求在106106個(gè)個(gè)m1m1用細(xì)菌浸沒培養(yǎng)物來保藏時(shí)，加入用細(xì)菌浸沒培養(yǎng)物來保藏時(shí)，加入4040的脫脂乳，混合制成含的脫脂乳，混合制成含106106個(gè)個(gè)mlml的均懸液。的均懸液。4 4取下安瓿上的棉塞，然后用取下安瓿上的棉塞，然后用lmllml移液管分裝安移液管分裝安瓿瓿(0.2ml(0.2ml瓿瓿) )，重新塞

23、好棉塞。，重新塞好棉塞。5 5輕輕振蕩安瓿，以使細(xì)胞重新懸浮。將安瓿輕輕振蕩安瓿，以使細(xì)胞重新懸浮。將安瓿與歧管相聯(lián)后迅速置于醇浴中，然后調(diào)節(jié)溫控與歧管相聯(lián)后迅速置于醇浴中，然后調(diào)節(jié)溫控裝置。使細(xì)胞懸液迅速凍結(jié)。裝置。使細(xì)胞懸液迅速凍結(jié)。6 615min15min后，將歧管與真空泵相通。后，將歧管與真空泵相通。7 7維持維持-40-40的醇浴溫度的醇浴溫度90 90 120min120min，然后調(diào)節(jié)，然后調(diào)節(jié)溫控裝置。使醇浴溫度上升至溫控裝置。使醇浴溫度上升至-10-10，維持，維持2h2h。8 8關(guān)掉可調(diào)溫控裝置的降溫探頭，讓醇浴溫度上關(guān)掉可調(diào)溫控裝置的降溫探頭，讓醇浴溫度上升至室溫升至室

24、溫(25)(25)9 9在冷凍干燥的最初在冷凍干燥的最初4h4h內(nèi)應(yīng)定期測(cè)真空度，在安內(nèi)應(yīng)定期測(cè)真空度，在安瓿置于真空下后瓿置于真空下后1h1h內(nèi)，真空度必須達(dá)到內(nèi)，真空度必須達(dá)到13.33Pa13.33Pa，并于菌懸液接近干燥時(shí)逐漸降到并于菌懸液接近干燥時(shí)逐漸降到2.672.674.0Pa4.0Pa。10 10 在真空狀態(tài)下，讓安瓿保存在冷凍干燥機(jī)在真空狀態(tài)下，讓安瓿保存在冷凍干燥機(jī) 中至少中至少16h16h以獲得完全干燥。以獲得完全干燥。1111干燥后，在干燥后，在2.672.674.00Pa4.00Pa的真空度下封瓶的真空度下封瓶1212在所有安瓿都封蓋好后，撤去真空。在所有安瓿都封蓋好

25、后，撤去真空。1313關(guān)閉真空泵。關(guān)閉真空泵。1414關(guān)閉冷凝器。關(guān)閉冷凝器。(2)(2)凍干菌種的保藏與再生凍干菌種的保藏與再生1 1保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于保藏：冷凍干燥后的培養(yǎng)物在低于55下保藏。下保藏。較低的保藏溫度較低的保藏溫度(-20(-20-70)-70)對(duì)于培養(yǎng)物的長期對(duì)于培養(yǎng)物的長期穩(wěn)定更好。穩(wěn)定更好。2 2復(fù)蘇：復(fù)蘇：(1)(1)在超凈工作臺(tái)中用在超凈工作臺(tái)中用7070酒精棉球擦洗安瓿，然酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。后用砂輪在安瓿中銼一道溝。(2)(2)用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿，然后用手掰用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開安瓿開安瓿(3)

26、(3)在安瓿中加入在安瓿中加入0.50.51ml1ml營養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢營養(yǎng)液體培養(yǎng)基，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復(fù)水。然后將此轉(zhuǎn)接到旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復(fù)水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中，或直接接種一含有再生培養(yǎng)基的無菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。瓊脂斜面或涂布平板。(4)(4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有直接振落入盛有l(wèi) l2ml2ml液體培養(yǎng)基的試管中，液體培養(yǎng)基的試管中，輕輕振蕩輕輕振蕩5 5l0minl0min，然后用此懸液接種適宜的，然后用此懸液接種適宜的再生培養(yǎng)基。再生培養(yǎng)基。( (二）二） 其他保藏方法其他保藏方法1.1.傳代保藏傳代保藏 2.2.礦物油中浸沒保藏礦物油中浸沒保藏 1.1.傳代保藏傳代保藏 將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代，然后在一將菌種定期在新鮮瓊脂培養(yǎng)基上傳代，然后在一定的生長溫度下生長和保存的傳代保藏方法。定的生長溫度下生長和保存的傳代保藏方法。 可用于實(shí)驗(yàn)室中若干菌種的保藏?？捎糜趯?shí)驗(yàn)室中若干菌種的保藏。 此法最為簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)，且不要