實驗四、凝膠DNA回收

1、實驗四、凝膠實驗四、凝膠DNA回收回收一、概論一、概論DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，有效地回收特定的DNA片段是進行隨后DNA克隆的一個主要步驟。回收的DNA片段的質(zhì)量的好壞將嚴重影響DNA轉(zhuǎn)化的效率。目前雖然有許多方法可從凝膠中回收DNA，如透析袋電洗脫法、低熔點瓊脂糖凝膠法、瓊脂糖酶法及DEAE-纖維素膜法等，但普遍存在以下問題： 1 大片段DNA不容易回收。 2 回收的DNA中存在酶反應(yīng)抑制物 3 少量DNA片段的回收率低。 二、實驗方法二、實驗方法 V-gene V-gene 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠DNADNA的回收試劑盒的回收試劑盒1 1、 試劑試劑塑料件：DNA制備管，2ml離心管。

2、DE-A溶液：凝膠熔化劑(含DNA保護劑，防止DNA在高溫下降解)。室溫密閉貯存。DE-B溶液：高離液序列溶液(促使大于100bp的DNA片段選擇性結(jié)合到DNA制備膜上），室溫密閉貯存。W1溶液： 洗滌液。室溫密閉貯存。W2溶液：脫鹽液。室溫密閉貯存。洗脫液：2.5mM Tris.HCl,pH8.5。室溫密閉貯存。2 2、實驗步驟、實驗步驟A. 在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎。計算凝膠重量(提前記錄1.5ml離心管重量)，該重量作為一個凝膠體體積(如100mg=100ul體積).B. 根據(jù)凝膠濃度，按下表所提供的參數(shù)加DE-ADE-A溶液溶液： 凝膠濃度

3、 DE-A溶液體積 1.0 3個凝膠體積 1.5 4個凝膠體積 20 5個凝膠體積 混合均勻后于70加熱(低熔點瓊脂糖凝膠于40加熱)，間斷搖晃，直至凝膠塊完全熔化(約6-8min).C. 在濾液中加0.5個DE-A體積的DE-BDE-B溶液溶液，混合均勻。當分離 的DNA片段小于400bp時，加入異丙醇至終濃度為20%。2 2、實驗步驟、實驗步驟( (續(xù)）續(xù)）D. 吸取步驟C中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNADNA制備管制備管(置于2 ml離心管)中，3600 rpm 離心1min。如制備管中有液體殘留，適當提高離心速度，再離心1min, 棄濾液。E. 將制備管置回離心管，加0.5ml W1W1溶液溶

4、液，3600rpm離心30s，棄濾液;F. 將制備管置回離心管，加0.7ml W2W2溶液溶液，3600rpm離心30s，棄濾液。再以同樣的方法洗滌一次。G. 將制備管置于離心管中，最高速度離心1min;H. 將制備管置于新的1.5ml離心管中，在DNADNA制備膜制備膜正中央加 25ul水或洗脫液溫靜置1min。最高速度離心1min洗脫DNA。I. 收集洗脫液，保存于-20，電泳檢測DNA片段回收情況。 3 3、注意事項、注意事項A.以下操作步驟適于從TAE或TBE瓊脂糖泳膠中提取DNA。從其它緩沖液電泳膠中提取DNA時，加入DE-B溶液后溶液的pH應(yīng)調(diào)整到65以下(步驟C)。B.在步驟A中，將疑膠切成細小的碎塊可大大縮短凝膠熔化時 間(線型DNA長時間暴露在高溫條件下易于水解)，從而提高回收率。勿將含DNA的凝膠長時間地暴露在紫外燈下，減少紫外線對DNA造成的損傷。C.在步驟B中凝膠必須完全熔化，否則將嚴重影響DNA回收率。D.如采用離心法，在步驟5B中吸回濾液到DNA制備管中再吸附一次，