水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器技術(shù)

1、水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器技術(shù)：高效制備重組蛋白的新利器生物谷生物探索2013.09.10摘妥：重組蛋臼藥物是新藥開發(fā)的重要方向之一。如今，重組蛋臼藥物西然僅占全球處 方藥市場(chǎng)的7-8%,但發(fā)展非常迅速，其中排名前十位的“重磅炸彈"藥占總銷僖額60%以 上。未來(lái)5-10年中國(guó)生物制藥領(lǐng)域仍將以重組蛋臼為主流，這與世界生物制藥領(lǐng)域的發(fā)展 趨勢(shì)吻合。但是，宜組蛋臼生產(chǎn)能力不足已經(jīng)成為重姐藥物發(fā)展的瓶頸，生產(chǎn)能力不足導(dǎo)致 生產(chǎn)成本提高，在一定程度上限制了產(chǎn)業(yè)化。最新出現(xiàn)的水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器技術(shù)解決 了其他技術(shù)產(chǎn)童低、大規(guī)模生產(chǎn)困難等問(wèn)題，成為髙效制備重組蛋臼的新利籠。1、技術(shù)簡(jiǎn)介水稻胚乳細(xì)

2、胞生物反應(yīng)器技術(shù)，是以分子生物學(xué)為原理，應(yīng)用遺傳工程和DNA重組, 以水稻胚乳作為“生產(chǎn)車間”高效表達(dá)各類蛋白質(zhì)，包括胚乳特異性表達(dá)、蛋白定向儲(chǔ)存、® 組資白質(zhì)的提取以及純化技術(shù)。該技術(shù)貝有表達(dá)最高、成本低、規(guī)?；菀住⒓庸すに嚭?jiǎn)單、 綠色壞保和安全性好的優(yōu)勢(shì)，各方面均優(yōu)于細(xì)曲，酵母，動(dòng)物細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等生產(chǎn)體系， 將可部分取代基丁微生物發(fā)酵和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)等重組蛋白藥物的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式，対我國(guó)乃至 國(guó)際的生物醫(yī)藥生產(chǎn)方式產(chǎn)生較大影響，對(duì)推動(dòng)我國(guó)生物醫(yī)藥的發(fā)展JV冇重要總義。表達(dá)系統(tǒng)總成本產(chǎn)品周期規(guī)?；a(chǎn)能力產(chǎn)品性能糖基化污染風(fēng)險(xiǎn)存儲(chǔ)成本細(xì)菌低低無(wú)內(nèi)毒素中酵母屮中高不正確低中動(dòng)物細(xì)胞

3、 培養(yǎng)高長(zhǎng)極低極高正確阮病毒和致癌病毒貴轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物離極長(zhǎng)低極高正確阮病毒和 致癌病毒貴植物細(xì)胞 培養(yǎng)中中中高較小差 異低中轉(zhuǎn)基因植 物極低長(zhǎng)極島島較小差 異低低二、技術(shù)原理在成熟水稻胚乳中淀粉占90%,儲(chǔ)存蛋白占8-10%o在水 稻胚乳細(xì)胞中儲(chǔ)存蛋白主要有谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白和 白蛋白儲(chǔ)存在水稻胚乳細(xì)胞中的兩種蛋白體中，即蛋白體I和 蛋白體|。在水稻開花受精后，隨著胚乳的發(fā)育，蛋白質(zhì)通過(guò) 基因轉(zhuǎn)錄成mRNA,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成蛋白質(zhì)，新合成的蛋白質(zhì) 通過(guò)信號(hào)肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，然后經(jīng)過(guò)高爾基體對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行加 工與修飾，成為貝有完全功能的蛋白質(zhì)，最終轉(zhuǎn)運(yùn)到這些蛋白 體中。整個(gè)過(guò)程是蛋白質(zhì)不斷的合

4、成，不斷的積累，使得儲(chǔ)存 蛋白總量在成熟時(shí)達(dá)到很高的水平。應(yīng)用上述原理以水稻胚乳細(xì)胞為“生產(chǎn)車間”，釆用胚乳細(xì) 胞特異性農(nóng)達(dá)，信號(hào)肽介導(dǎo)重組蛋白質(zhì)定向儲(chǔ)存，目的基因P, 一的水稻密碼子優(yōu)化等技術(shù)策略,不僅可以使重組蛋白像儲(chǔ)存 水稻胚乳細(xì)胞蛋白合成不意圖蛋白一樣在蛋白體中人鼠積累而達(dá)到高效表達(dá)，而且可以防I匕細(xì)胞質(zhì)蛋白酶的降解，在蛋白 質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中還可以對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行加工修飾，獲得具何生物活性的重組蛋白質(zhì)。再利用 水稻儲(chǔ)存蛋白與重組蛋白的生化性質(zhì)差異，將重組蛋白提取出來(lái)并進(jìn)行純化。在水稻胚乳細(xì)胞中特異表達(dá)巫組蛋白三、技術(shù)優(yōu)勢(shì)本表達(dá)技術(shù)平臺(tái)是以種子為蛋白質(zhì)生產(chǎn)車間來(lái)表達(dá)和生產(chǎn)各種醫(yī)用、工業(yè)用的蛋

5、白質(zhì)的 分子醫(yī)藥農(nóng)業(yè)技術(shù)。種子生物反應(yīng)器利用蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)藏的機(jī)制可以使更組蛋白在翻譯和轉(zhuǎn) 運(yùn)的過(guò)程中受到轉(zhuǎn)運(yùn)小泡等生物膜的保護(hù)，不會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶降解，而獲得更高的表達(dá) 量。因此種子被認(rèn)為是植物生物反應(yīng)器的繪理想器官之一。通過(guò)種子生物反應(yīng)器來(lái)表達(dá)各種蛋白質(zhì)，將甫組蚩白質(zhì)定向儲(chǔ)藏在蛋白體，避免了蛋白 酶的降解，在種子成熟過(guò)程中不斷地積累，從而獲得較高表達(dá)；同時(shí)重組蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)膜系 統(tǒng)，可進(jìn)行正確地加工與折疊，產(chǎn)生具有生物活性的重組蛋白質(zhì)。八體優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)如下：1.表達(dá)量高：通過(guò)表達(dá)多種不同人源蛋白質(zhì)，表達(dá)量在20-150微克/種子之間，折 合為0.10.75%的糙米車呂。各種蛋白質(zhì)的表達(dá)雖總結(jié)如下

6、表。蛋白質(zhì)種類分子量表達(dá)量（微克/粒）備注簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)13-100 kDa80-180HSA、乳鐵蛋白等細(xì)胞生長(zhǎng)因子類10-15kDa10-15IGF、FGF 等蛋白酶類13-100kDa30-120人溶菌酶、抗胰蛋白酶等復(fù)合蛋白質(zhì)75-150 kDa20-50單克隆抗體2. 牛.物活件高：各種人體及動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)據(jù)證明通過(guò)該平臺(tái)表達(dá)的人血門蛋門的活 性比血漿來(lái)源的人血白蛋白活性高:PPE方式對(duì)比測(cè)試證明植物源重組抗胰蛋白酶比山場(chǎng)現(xiàn) 有抗胰蛋白酚產(chǎn)品的活性高出7.8%74.4%。3. 生產(chǎn)成本低：由F利用水稻胚乳生物反應(yīng)器貝有校高的表達(dá)水平，人規(guī)模生產(chǎn)以農(nóng) 業(yè)生產(chǎn)方式進(jìn)行，因而生產(chǎn)成本極低，

7、相對(duì)丁其他生產(chǎn)體系，利用植物生產(chǎn)體系的生產(chǎn)成本 是英他體系的l/200-l/10o4. 規(guī)模化容易：由于水稻的繁殖細(xì)胞達(dá)到1000倍以上，一旦獲得高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因品系 后，即可在短期內(nèi)獲得人規(guī)模生產(chǎn)，從基因介成到規(guī)?；a(chǎn)（kg）只需要24個(gè)月時(shí)間。5. 安全性高：水稻是一種廣泛種植、并II茂用了幾年的谷物，尚未發(fā)現(xiàn)任何植物病 毒或病原菌與人類交義感染的先例，而Fl我們的提取和純化匸藝可杜絕任何引進(jìn)的病毒或病 原菌，以完全避免動(dòng)物成分或病毒、病原菌通過(guò)醫(yī)藥產(chǎn)品進(jìn)行傳播風(fēng)險(xiǎn)。6. 儲(chǔ)藏運(yùn)輸方便：種子是理想的”天然容器”，笊組蛋白質(zhì)儲(chǔ)藏在胚乳細(xì)胞的蛋白體內(nèi)， 處于膠體狀態(tài)，極為穩(wěn)定，通常在常溫下儲(chǔ)藏

8、23年，即使胚損壞喪失了發(fā)芽能力,胚乳中 的蛋白質(zhì)也不會(huì)喪失生物活性，因此原料儲(chǔ)藏、運(yùn)輸不受時(shí)空限制。7. 低碳環(huán)保：利用水稻胚乳生物反應(yīng)器生產(chǎn)醫(yī)藥產(chǎn)品，改傳統(tǒng)生物發(fā)酵為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)種 植，蛋白質(zhì)的合成與累積足由植物細(xì)胞通過(guò)光合作用合成，可以節(jié)省傳統(tǒng)醫(yī)藥工業(yè)需要的大 量能源和原材料，符合現(xiàn)代工業(yè)低碳環(huán)保的理念。四、技術(shù)流程本技術(shù)包含基因載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化、植株再生、蛋白質(zhì)純化等6個(gè)步驟，技術(shù)流程圖 及技術(shù)步驟如下：在種子里特異表達(dá)技術(shù)流程圖1、水稻胚胎細(xì)胞特:異性衣達(dá)我體的構(gòu)建;克隆水稻胚乳特異性啟動(dòng)子Gtl3a,將Gtl3a啟動(dòng)子連接到表達(dá)我體上形成水稻胚乳細(xì) 胞特異性表達(dá)戟體。通過(guò)對(duì)水稻儲(chǔ)藏蛋

9、白基因心動(dòng)子結(jié)構(gòu)的比校分析，Gtl3a W動(dòng)子比國(guó)際 上專利保護(hù)的Gtl 動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性高44.84%,通過(guò)多種重組蛋白質(zhì)的表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明，Gtl3a 可介導(dǎo)垂組蛋白在胚乳中高效和特異性表達(dá)，使植物生物反應(yīng)器的表達(dá)量從納克級(jí)提升到微 克級(jí)。2、水稻遺傳密碼子優(yōu)化的產(chǎn)組蛋白質(zhì)基因合成與表達(dá)我體的構(gòu)建；將重組蛋白基因的氨基酸序列轉(zhuǎn)化成含仃優(yōu)化的水稻遺傳密碼子核苗酸序列，連接到水 稻胚乳細(xì)胞特異性表達(dá)載體上。3、將所獲得的我體轉(zhuǎn)化到水稻品種的愈傷再生組織中，經(jīng)篩選和誘導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株；將帶有冃的蛋白基因的表達(dá)載體甫組到水稻基兇中.與水稻自身的基因融合為一體.這 個(gè)整合后的基因組在水稻種株中表達(dá)形成轉(zhuǎn)

10、基內(nèi)種株，使得目的蛋白隨著水稻口身的基月通 過(guò)轉(zhuǎn)錄.翻譯、折疊等一系列過(guò)程表達(dá)出來(lái)，儲(chǔ)藏在水稻種子中。Gtl3a介導(dǎo)重組蛋白進(jìn)入水稻胚乳細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)并儲(chǔ)藏在水稻胚乳的蛋白體中從而 使重組蛋白在水稻種子內(nèi)人屋枳累最終達(dá)到較高的表達(dá)量以降低生產(chǎn)成本，為蛋白藥物的生 產(chǎn)開辟了新途徑。Protein gen©GM riceGM riceRecombinant plasmidtRe-generationEndosperm in seedGenetic transformation nce callus獲取轉(zhuǎn)基因水稻品種Recombinant proteinaccumulate in prot

11、ein body4、大規(guī)模種植轉(zhuǎn)基因水稻獲得轉(zhuǎn)基內(nèi)種子，并建立穩(wěn)定的種子庫(kù)；5、以轉(zhuǎn)某因種子為原料.將其磨碎后加入提取緩沖液提取施組蛋H質(zhì):6、提取的蛋白質(zhì)通過(guò)層析對(duì)提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)而獲得高純度的 重組蛋白?；诂F(xiàn)有水稻基因組數(shù)據(jù)和種子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究，針對(duì)水稻胚乳儲(chǔ)藏蛋白和冃的蛋白 的理化性質(zhì)差異，建立一整套從水稻種子中提取和純化重組蛋白的工藝、工藝流程以及不同 重組蛋白質(zhì)的提取純化工藝設(shè)計(jì)的原則，然后利用此原則進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。該純化工藝流程 包括種子加工、蛋白質(zhì)提取與蛋白提取物預(yù)處理、膜處理、柱層析和超濾透析等技術(shù)。五. 技術(shù)常見問(wèn)題與注意事項(xiàng)1、用水稻胚乳來(lái)表達(dá)重組蛋

12、白質(zhì)所需要的時(shí)間？人概的費(fèi)用？答：作為第一階段：獲得表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)基因植株，需要10個(gè)月左右的時(shí)間，費(fèi)用根據(jù) 貝體表的蛋白不同而不同，在50-80萬(wàn)/基因之間。第二階段是純化工藝，根據(jù)所表達(dá)的 蛋白不同，依純化的難以程度業(yè)有所不同，一般在150-450萬(wàn)之間，在這階段可獲得小試 工藝和活性以及樣品，達(dá)到規(guī)?；a(chǎn)則需要2年左右的時(shí)間。2、水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器技術(shù)是否可以表達(dá)治療用抗體藥物？例如？答：完全可以。但存在糖蛋白修飾問(wèn)題，目前正在建立人源糖苛化技術(shù)平臺(tái)，估計(jì)在明 年可以建立人源化糖廿修飾的體系。3、分離純化得到的蛋白的產(chǎn)量是由蛋白本身性質(zhì)決定的還是由水稻自身轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)決定 的？答：蛋

13、白表達(dá)是從DNA復(fù)制到RNA轉(zhuǎn)錄再到合成蛋白質(zhì)的過(guò)程，它的表達(dá)量取決于3 個(gè)方面：1）啟動(dòng)子活性的高低.即RNA轉(zhuǎn)錄幽的活性，轉(zhuǎn)錄解的活性高，蛋白質(zhì)產(chǎn)量不一定高， 還有蛋白質(zhì)翻譯的調(diào)控；2）蛋白質(zhì)翻譯水平的效應(yīng)：3）蛋白質(zhì)翻譯后的調(diào)控，即蛋白質(zhì)的降解過(guò)程。一旦合成蛋白質(zhì)出現(xiàn)不能正確地折疊， 細(xì)胞啟動(dòng)一個(gè)叫做蛋白質(zhì)降解程序，叫沒折疊貴白質(zhì)降解程序，將沒冇功能的蛋白質(zhì)降解:解決方法：1）采用高活性的啟動(dòng)子；提高轉(zhuǎn)錄水平；2）采用密碼子優(yōu)化：提高轉(zhuǎn)錄和翻譯效應(yīng)；3）定向蛋白質(zhì)儲(chǔ)存。將蛋白質(zhì)放入水稻胚乳中的蛋白體儲(chǔ)存，可以避免細(xì)胞質(zhì)的蛋白 酶降解。4、怎樣將蛋白質(zhì)導(dǎo)入到水稻中？答：首先克隆出此蛋白質(zhì)的

14、基因，然后把這段基因插入到雙元農(nóng)桿菌我體DNA中，帶 有此蛋白質(zhì)的質(zhì)粒覓組到水稻基因中與水稻自身的基因組整介為一體，最后這個(gè)整合后的基 因組在水稻植株中表達(dá)形成轉(zhuǎn)基因種株，從而啦組蛋白也隨普水稻自身的基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻 譯、折疊等一系列過(guò)程表達(dá)出來(lái)。六、最新的研究文獻(xiàn)1 He Y et al. Large-scale production of fiinctional human semm albumin from transgenic rice seeds. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108:19078 19083.2. Na An. et al. Expre

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