酶基因的隨機(jī)突變

1、酶基因的隨機(jī)突變1 引言：酶分子的定向進(jìn)化簡(jiǎn)稱為酶定向進(jìn)化，是模擬自然進(jìn)化過程（隨機(jī)突變和自然選擇） ，在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變，建立突變基因文庫， 在人工控制條件的特殊環(huán)境下， 定向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體的技術(shù)過程。酶定向進(jìn)化的基本過程包括隨機(jī)突變，構(gòu)建基因文庫，定向選擇等步驟。酶的定向進(jìn)化的第一步是在體外人為的進(jìn)行積陰德隨機(jī)突變， 以獲得豐富多樣的突變基因， 為后續(xù)的定向選擇打下基礎(chǔ)。酶基因的體外隨機(jī)突變首先要獲得酶基因，然后在體外進(jìn)行隨機(jī)突變，體外隨機(jī)突變的技術(shù)多種多樣，主要有易錯(cuò) PCR 技術(shù)， DNA重排技術(shù)，基因家族重排技術(shù)等。這些突變方法的目標(biāo)都是為了獲得豐富

2、多樣的突變基因，但是各自采用的進(jìn)化策略和側(cè)重點(diǎn)有所不同， 易錯(cuò) PCR技術(shù)是從酶的單一基因出發(fā)， 通過改變聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件， 如改變底物和鎂離子濃度等， 在 PCR擴(kuò)增過程中， 使堿基配對(duì)錯(cuò)誤而引起基因突變； DNA重排技術(shù)是從兩條以上的正突變基因出發(fā)，經(jīng)過酶切和不加引物的 PCR擴(kuò)增，使 DNA堿基序列重新排布而引起的基因突變；基因家族重排技術(shù)是從基因家族的多個(gè)同源基因出發(fā)，經(jīng)過酶切和不加引物的 PCR擴(kuò)增等，使 DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變。 這些隨機(jī)突變方法可以單獨(dú)使用， 也可以聯(lián)合使用，交叉進(jìn)行，通過多次試驗(yàn)，反復(fù)篩選，就可以完成對(duì)酶的定向進(jìn)化。2 酶基因的隨機(jī)突變常用技

3、術(shù)：2.1，易錯(cuò) PCR 技術(shù)：在 DNA 聚合酶的作用下進(jìn)行體外 DNA 擴(kuò)增的一種分子生物學(xué)技術(shù)，簡(jiǎn)稱為 PCR 技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的基本過程包括雙鏈 DNA 的變性，引物與單鏈 DNA 退火結(jié)合，引物延伸三個(gè)步驟。2.1.1，雙鏈 DNA 的解鏈：將待擴(kuò)增的模板雙鏈之間的氫鍵斷開，解離為單鏈DNA 。DNA升溫至8595 度，使DNA2.1.2，引物與單鏈 DNA 退火結(jié)合：?jiǎn)捂湑?huì)與堿基互補(bǔ)的引物結(jié)合形成雙鏈，長度為DNA 在溫度逐步降低至1530 個(gè)堿基。5070 度是，2.1.3，引物延伸：引物結(jié)合后，將溫度升高至7075度，在DNA 聚合酶的作用下，以引物為起點(diǎn)，以 4 種脫

4、氧核苷三磷酸為底物，以目標(biāo) DNA 為模板，按照堿基配對(duì)原則，由 5端向 3端的方向延伸，而進(jìn)行 DNA 復(fù)制。以上三個(gè)步驟反復(fù)進(jìn)行， 一般經(jīng)過 30 次循環(huán)，即可使目的基因擴(kuò)增幾百萬倍。在 PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過改變反應(yīng)條件，增加堿基配對(duì)錯(cuò)誤的出現(xiàn)頻率，就成為易錯(cuò) PCR 技術(shù)。2.2DNA 重組技術(shù)：又稱為DNA 改組技術(shù)，是從正突變基因文庫中分離得到的同源 DNA ，勇酶切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過不加引物的多次 PCR 循環(huán)，是 DNA 的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。 DNA 重排技術(shù)是 1994 年由斯田沫等首次提出，他們通過該技術(shù)對(duì) 內(nèi)酰胺酶進(jìn)行了定向進(jìn)化研究，是該酶的催

5、化效率提高了 32000 倍。 DNA 重排技術(shù)的基本過程如圖所示：2.3 基因家族重排技術(shù)： 又稱為基因家族改組技術(shù)， 是從基因家族的若干同源基因出發(fā)，勇酶切割成隨機(jī)片段， 經(jīng)過不加引物的多次 PCR 技術(shù)，使 DNA 的堿基序列發(fā)生重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。 基因家族重排技術(shù)的主要過程如圖所示：3 酶基因隨機(jī)突變的應(yīng)用：酶基因的隨機(jī)突變時(shí)酶定向進(jìn)化的第一步，所以特別重要。定向進(jìn)化技術(shù)主要用于酶的改性方面， 如提高酶催化的效率， 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性， 改變酶的底物特異性等方面。3.1 提高酶的催化效率： 內(nèi)酰胺酶是一種催化內(nèi)酰胺水解的酶，在該酶的作用下，可使 內(nèi)酰胺類抗生素的內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)被破壞而失去活性。 1994 年，斯田沫等通過 DNA 重排技術(shù)進(jìn)行定向進(jìn)化，使 內(nèi)酰胺酶的催化效率提高 32000 倍，大大提高了突變菌株對(duì)于抗生素的耐受能力。3.2 增加酶的穩(wěn)定性： 淀粉酶是一種在食品、醫(yī)藥、輕工等領(lǐng)域有廣泛用途的催化淀粉水解的工業(yè)用酶， 喬耶等通過定向進(jìn)化， 獲得熱穩(wěn)定性大大提高的 淀粉酶，該酶在 90 度的半衰期延長 910 倍。