Western_Blotting免疫印跡(試劑配制每步操作詳解WB常見問題分析分離范圍)

1、Western（試劑配制和操作步驟）試劑配制：（一）母液（二）使用液操作步驟：（一）蛋白樣品制備（二）蛋白含量的測定（三）SDSPAGE電泳 （四）轉(zhuǎn)膜（五）免疫反應(yīng)（六）化學(xué)發(fā)光，顯影，定影（七）凝膠圖象分析關(guān)鍵詞：印跡試劑 Western 印跡法 免疫反應(yīng) 蛋白樣品制備 SDSPAGE電泳這種技術(shù)是把電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體，并以針對特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針檢測之。 Western使用的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。這種技術(shù)的作用是對非放射性標(biāo)記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特異蛋白進行鑒別和鑒定。耗材： 硝酸纖維素膜，乳膠

2、手套，保鮮膜，搪瓷盤（2020cm），X-光片夾，X-光片，玻棒長短各一根，計時器，吸水紙，試劑配制：（一）母液1.0mol/L TrisHCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸餾水 200ml 溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至所需點（見下所示），最后用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。 PH HCl 7.4 約17ml 7.5 約16m 7.6 約15ml 8.0 約10ml10SDS SDS 10g 蒸餾水至 100ml50水浴下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10過硫酸胺（AP） 過硫酸胺 0.1g 超純水 1.0ml溶解后，4保存，保存

3、時間為1周。1.5mol/L TrisHCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超純水 200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至8.8，最后用超純水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。0.5mol/L TrisHCl（pH6.8）Tris (MW121.14) 15.14g 超純水 200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至6.8，最后用超純水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。20Tween20Tween20 20ml 蒸餾水至 100ml混勻后4保存。（二）使用液單去污劑裂解液（50mmol/L TrisHCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1TritonX

4、100，100?g/ml PMSF）： 1mol/L TrisHCl（pH8.0） 2.5mlNaCl 0.438gTritonX100 0.5ml蒸餾水至50ml 混勻后， 4保存。使用時，加入PMSF至終濃度為100?g/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50l）。0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）NaCl 8.0gKCl 0.2gNa2HPO4 1.44g (Na2HPO4.H2O 1.56g Na2HPO4.12H2O 3.58g)KH2PO4 0.2g蒸餾水至 1000mlG250考馬斯亮藍(lán)溶液（測蛋白含量專用） 考馬斯亮藍(lán)G250： 100m

5、g 95乙醇： 50ml 磷酸： 100ml 蒸餾水至 1000ml 配制時，先用乙醇溶解考馬斯亮藍(lán)染料，再加入磷酸和水，混勻后，用濾紙過濾，4保存。0.15 mol/L NaCl NaCl（MW58.44） 0.877g 蒸餾水至 100 ml高溫滅菌后，室溫保存。100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）BSA 0.1g 0.15 mol/L NaCl 1ml溶解后，20保存。制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線時，用0.15 mol/LNaCl進行100倍稀釋成1mg/ml，20保存。10分離膠和5濃縮校10分離膠（兩塊膠，10ml） 5濃縮膠（兩塊膠，5ml）10%AP（過硫酸胺） TEMED加 TEMED

6、后，立即混勻即可灌膠。還原型5XSDS上樣緩沖液（0.25mol/L Tris?HCl pH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10 SDS，0.5溴酚藍(lán)，50甘油）0.5 mol/L TrisHCl（pH6.8） 2.5ml二硫叔糖醇（DTT，MW154.5） 0.39gSDS 0.5g溴酚藍(lán) 0.025甘油 2.5ml混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4保存。電泳液緩沖液（25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1 SDS）Tris（MW121.14） 3.03g甘氨酸（MW75.07） 18.77gSDS 1g蒸餾水至 1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用35

7、次。轉(zhuǎn)移緩沖液（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037 SDS，20甲醇）半干轉(zhuǎn)1X電轉(zhuǎn)液：甘氨酸（MW75.07） 2.9gTris（MW121.14） 5.8g SDS0.37g 甲醇 200ml蒸餾水至 1000ml溶解后室溫保存，次溶液可重復(fù)使用35次。濕轉(zhuǎn)1X電轉(zhuǎn)液：甘氨酸（MW75.07） 11.25gTris（MW121.14） 2.375g SDS0.375g 甲醇 200ml蒸餾水至 1000ml溶解后4保存，次溶液可重復(fù)使用35次。TBS緩沖液（100mmol/ L Tris?HCl pH7.5,150mmol/L NaCl）1 mol/ LTris

8、HCl（pH7.5） 10mlNaCl 8.8g蒸餾水至 1000mlTBST緩沖液（含 0.05Tween20的TBS緩沖液） 20Tween20 1.65mlTBS 700ml混勻后即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。封閉液（含5脫脂奶粉的TBST緩沖液）脫脂奶粉（國產(chǎn)，安怡牌） 5g TBST100ml溶解后4保存。使用時，恢復(fù)室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用。洗脫抗體緩沖液（100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2SDS，62.5m mol/L TrisHCl pH6.8）14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(-巰基乙醇) 700 ml（通風(fēng)廚里加） S

9、DS 2g 0.5mol/L TrisHCl（pH6.8） 12.5ml 超純水至 100ml配制時，在通風(fēng)廚內(nèi)進行。 4保存?？芍貜?fù)使用1次。10X麗春紅染液麗春紅S 2g三氯乙酸 30g磺基水楊酸 30g蒸餾水至 100ml使用時將其稀釋10倍。顯影液：H2O 365ml A 125ml B 5.1ml C 4.875ml4保存。定影液H2O 363.5ml A 125ml B 11.5.ml4保存?？贵w 用TBST稀釋至一定濃度使用，每張膜需0.5ml化學(xué)發(fā)光試劑購自北京中山公司，為Santa Cruz產(chǎn)品，分A和B兩種試劑。操作步驟SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜封閉一抗顯色或化學(xué)發(fā)光顯影二抗蛋白

10、樣品制備洗膜（一） 蛋白樣品制備（1）貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。海ㄕ麄€操作盡量在冰上進行）收集細(xì)胞，加裂解液100ul漩渦混勻，冰上裂解30min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。在4下12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中并置于20保存。（二） 蛋白含量的測定（1） 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1、 從20取出1mg/ml BSA，室溫融化后，備用。2、 取適量的蛋白標(biāo)準(zhǔn)稀釋至終濃度0.5 mg/ml ；按照下表將0.5mg/ml BSA和稀釋液PBS加到96孔板中，并取樣品2ul加入96孔板中，加PBS至20ul.（樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均設(shè)置復(fù)孔）3、 按A:B=50:1配制適量的BCA

11、工作液，混勻，室溫24h內(nèi)穩(wěn)定。各孔加入200ulBCA工作液3730min測定A562，求平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。編號123456780.5mg/ml BSA(ul)01248121620PBS(ul)2019181612840得到標(biāo)準(zhǔn)BSA濃度(ugul)00.0250.050.10.20.30.40.5（三） SDSPAGE電泳電泳時間一般為23h，電壓為80V 30min;120V 3h較好，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。SDS-PAGE 分離膠濃度最佳分離范圍6%50-150kD8%30-90kD10%20-80kD12%12-60kD15%10-40kD 配制10%的過硫

12、酸銨 配制12%分離膠（5ml) 待膠灌至距離玻璃板頂端1.5cm的時候停止灌膠，加入蒸餾水 聚合40分鐘后，倒掉蒸餾水 配制5%濃縮膠（2ml）灌濃縮膠 插上梳子，聚合20分鐘 注意：灌膠過程中避免產(chǎn)生氣泡（四）轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜詳細(xì)操作過程：（1）轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.08.0cm的濾紙和1張7.38.6cm的PVDF膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。PVDF膜則在M-OH中浸泡10min以上后轉(zhuǎn)入TBS液中平衡。將濾紙浸入TBS液中潤濕。（2）在加有轉(zhuǎn)膜液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。（3）將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用

13、玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。（4）要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板（撬時一定要小心，玻板很易裂）。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。輕輕劃開分離膠與玻板左右兩邊的接觸面，不然取膠時容易弄破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠并除氣泡（膜蓋下后不可再移動）。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。

14、最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)膜液中進行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。注意膜在正極+側(cè)，分離膠在負(fù)極-側(cè)。標(biāo)記正反面。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通）（5）將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。濕轉(zhuǎn)一般用400mA轉(zhuǎn)移1:30 h，根據(jù)分子量大小調(diào)整。轉(zhuǎn)移方法的選擇：v 半干轉(zhuǎn) 用濾紙吸buffer來做轉(zhuǎn)移體系的轉(zhuǎn)移方法； 適合轉(zhuǎn)移小分子量的蛋白； 半干轉(zhuǎn)的電流大小是按照面積來算的，時間是根據(jù)蛋白分子大小定的； 1.2-2MA/CM2 1h

15、v 濕轉(zhuǎn) 將膜、膠、濾紙整個浸泡在buffer的Tank里轉(zhuǎn)移的方法； 適合轉(zhuǎn)移大分子量（100KD以上）蛋白； 濕轉(zhuǎn)電流是恒定的，時間也是根據(jù)分子量而定； 300mA 1h（五）免疫反應(yīng)（1）封閉：轉(zhuǎn)完后將膜用去離子水或TBST從下向上浸濕后吸干，將膜在含5%脫脂奶粉的TBST(10mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl, 0.05%Tween-20)的平皿中，室溫下封閉1h。（2）一抗孵育：將一抗用一抗稀釋液或TBST稀釋至適當(dāng)濃度（在15ml離心管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，

16、用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育12h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。(本實驗室用封膜機將膜蛋白密封)（3）二抗孵育： 同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育12h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。（六）化學(xué)發(fā)光，顯影，定影（1）將A和B兩種試劑在EP管中等體積混合；1min后，將此混合液充分涂抹在膜蛋白面上；1min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。（2）在暗室中，將1顯影液和定影液分

17、別到入塑料盤中；在紅燈下取出X光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L和寬均需大1cm）；打開X-光片夾，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關(guān)上X-光片夾，開始計時；根據(jù)信號的強弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間，一般為1min或5min，也可選擇不同時間多次壓片，以達最佳效果；曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間一般為12min（2025），溫度過低時（低于 16）需適當(dāng)延長顯影時間；顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時間一般為510min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動膠片

18、時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片，否則會對結(jié)果產(chǎn)生影響。（七） 凝膠圖象分析將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。 高背景 信號弱或者無信號 非特異性條帶 信號下降太快高 背 景信號弱或無信號原因解決辦法抗原量不足增加上樣量蛋白質(zhì)在儲存過程中降解重新制備樣品轉(zhuǎn)膜不完全轉(zhuǎn)膜后確定轉(zhuǎn)膜效率、保證膠與膜充分結(jié)合、保證電極正確裝配、控制轉(zhuǎn)膜溫度（冰袋降溫）、優(yōu)化轉(zhuǎn)膜電流及時間。膜的錯誤選擇選擇合適膜的孔徑：22kD 蛋白選用 0.45m孔徑 22kD 蛋白選用 0.22m孔徑抗原被封閉液遮蔽優(yōu)化封閉液、縮短封閉時間、減小封閉液中蛋白濃度。抗體增加抗體濃度、注意抗體儲存條件（避免反復(fù)凍融）。曝光時間過短延長曝光時間底物延長底物孵育時間非特異性條帶原因解決辦法底物太靈