兒童急性淋巴細(xì)胞白血病IKZF1基因表達(dá)研究醫(yī)藥生物類專業(yè)畢業(yè)論文畢業(yè)設(shè)計

1、四川大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)碩士專業(yè)學(xué)位論文聲 明本人聲明所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包括其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包括為獲得四川大學(xué)或其他機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所作的任何貢獻(xiàn)均已在論文中做了明確的說明并表示謝意。本學(xué)位論文成果是本人在四川大學(xué)就讀期間取得的，論文成果歸四川大學(xué)所有，特此聲明。 論文作者簽名： 指導(dǎo)教師簽名：兒童急性淋巴細(xì)胞白血病IKZF1基因表達(dá)研究Expression of Active and Dominant-Negative IKZF1 T

2、ranscripts in Children with Acute Lymphoblastic Leukemia七年制研究生：夏 帆 導(dǎo) 師：高 舉 教授 指 導(dǎo) 教 師：袁粒星 副教授目 錄縮略詞表.1中文摘要.5英文摘要.7前 言.材料與方法.結(jié) 果.討 論.全文總結(jié).參考文獻(xiàn).綜 述.致 謝.縮 略 詞 表（按字母順序排序）縮寫英文中文全稱ALLacute lymphocytic leukemia急性淋巴細(xì)胞白血病BCRB-cell antigen receptorB細(xì)胞抗原受體bpbase pair堿基對CCLGChildrens Cancer and Leaukaemia Group

3、 兒童腫瘤與白血病協(xié)作組CDcluster of differentiation分化抗體群cDNAcomplementary DNA互補(bǔ)DNAddH2Odouble-distilled water雙蒸水DEPCdiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯GAPDHglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase甘油醛-3-磷酸脫氫酶GMPgranulo-monocyte progenitors粒-單核前體細(xì)胞HSChaemopoietic stem cell造血干細(xì)胞IKZF1(IK)Ikaros family zinc fingerIkaros 家族鋅指

4、LMPPlymphoid-primed multipotent progenitors有淋巴細(xì)胞傾向的多潛能前體細(xì)胞mRNAMessenger RNA信使RNAODoptical density difference吸光度差Pprobability可能性PBSPhosphate Buffered Saline磷酸鹽緩沖液PCRPolymerase Chain Reaction聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Ph+Philadelphia Chromosome positive費城染色體陽性RIribonuclease inhibitor核糖核酸酶抑制因子rpmrotation per minute每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)Td

5、Tterminal deoxynucleotidyl transferase末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶WBCWhite blood cells白細(xì)胞中文摘要目的 研究兒童ALL骨髓單個核細(xì)胞IKZF1(IK)基因可變剪接轉(zhuǎn)錄本表達(dá)情況，及其在各種臨床預(yù)后因素ALL亞組的表達(dá)譜(expression pattern)，探討其與兒童ALL發(fā)病和預(yù)后的可能關(guān)系。方法 采用巢式RT-PCR方法，檢測我院兒童血液腫瘤科收治的43例ALL患兒骨髓單個核細(xì)胞和20例健康對照兒童外周血單個核細(xì)胞功能性IK和顯性負(fù)IK轉(zhuǎn)錄本表達(dá)情況，并經(jīng)DNA測序證實，統(tǒng)計分析不同預(yù)后因素ALL患兒IK可變剪接轉(zhuǎn)錄本的陽性表達(dá)率。結(jié)

6、果 ALL患兒IK表達(dá)譜與健康對照兒童IK表達(dá)譜具有明顯差異。盡管兩組研究對象均表達(dá)IK各種轉(zhuǎn)錄本(包括功能性和顯性負(fù)IK轉(zhuǎn)錄本)，但對照組除1例外均表達(dá)功能性IK(尤其是IK2)，其表達(dá)水平明顯高于顯性負(fù)IK表達(dá)水平。而大多數(shù)ALL患兒表達(dá)顯性負(fù)IK，約44%的ALL患兒甚至僅較高水平表達(dá)一種或多種“顯性負(fù)”IK。1. ALL患兒IK2陽性表達(dá)率為51%，而對照組IK2陽性表達(dá)率為95%；ALL患兒和對照組功能性IK (IK1+IK2)陽性表達(dá)率分別為58%和95%，對照組陽性表達(dá)率均顯著高于ALL組(P<0.05)。2. 盡管從IK4陽性表達(dá)率而言，ALL顯性負(fù)IK4陽性表達(dá)率(39

7、.6%)顯著低于對照組(90%) (P<0.05)，但從圖3和圖4可以比較直觀地發(fā)現(xiàn)，ALL患兒IK4表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對照組。其他2種顯性負(fù)IK陽性表達(dá)率組間無顯著性差異(P>0.05)。3. 標(biāo)危組、中危組和高危組ALL功能性IK(IK1+IK2)陽性表達(dá)率分別為80%、67%和37.5%；標(biāo)中危合并ALL組和高危ALL組功能性IK(IK1+IK2)陽性表達(dá)率分別為74%和37.5%，均具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P<0.05）。單獨統(tǒng)計分析不同臨床危險度ALL間各種顯性負(fù)IK陽性表達(dá)率無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。4. 潑尼松敏感ALL功能性IK(IK1+IK2)陽性表達(dá)率(71%)顯著高

8、于潑尼松不敏感ALL(22%)(P<0.05)，但組間單一顯性負(fù)IK陽性表達(dá)率并無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。5. 除顯性負(fù)IK6外，初診WBC<50´109/L和初診WBC³50´109/L兩組ALL患兒IK陽性表達(dá)率無顯著性差異。結(jié)論 本文在國內(nèi)首次研究比較了ALL患兒骨髓單個核細(xì)胞和健康對照兒童外周血單個核細(xì)胞IK表達(dá)譜，及其與ALL各種預(yù)后因素的關(guān)系。初步研究結(jié)果顯示，兩組研究對象IK表達(dá)譜具有顯著差異，ALL患兒功能性IK陽性表達(dá)率顯著低于對照兒童，而且高危以及潑尼松不敏感ALL組功能性IK陽性表達(dá)率也顯著降低，提示IK可能在兒童ALL發(fā)病中發(fā)揮著重要

9、作用，IK異常表達(dá)（功能性IK低表達(dá)和或顯性負(fù)IK高表達(dá)）可能是具有高危不良預(yù)后因素ALL的一個普遍特征。關(guān)鍵詞 急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)；Ikaros家族鋅指蛋白1( IKZF1)；巢式PCR；DNA測序；表達(dá)譜 (expression pattern)；兒童Expression of Active and Dominant-Negative IKZF1 Transcripts in Children with Acute Lymphoblastic LeukemiaPostgraduate: Xia Fan Tutor: Gao Ju, Prof of PediatricsABSTRA

10、CTOBJECTIVES: To determine the expression patterns of active and alternatively spliced dominant-negative Ikaros (IK) transcripts in children with acute lymphoblastic leukemia (ALL), and to explore the possible correlations between Ikaros expression and various prognostic risk factors in ALL.METHODS:

11、 The expression patterns of IK transcripts in bone marrow mononuclear cells and peripheral mononuclear cells, isolated from 43 children with ALL and 20 age-and sex-matched control children respectively, were determined by nested RT-PCR. The identities of various functional /active and dominant-negat

12、ive IK transcripts were judged by their corresponding electrophoretic positions on agarose gel and further confirmed by DNA sequencing. Expression positivities of every active and dominant-negative IK transcripts were compared between ALL group and control, and between ALL subgroups with different p

13、rognostic risk factors.RESULTS:1. Although both active and dominant-negative IK transcripts were expressed in mononuclear cells from ALL and normal control children, distinct overall expression patterns were documented in the two groups. High levels of expression of active IK (especially IK2) were d

14、etected in the majority of controls, while dominant-negative IKs were expressed in most of ALL cases, with 44% of ALL expressing exclusively one or more dominant-negative IK transcripts. 2. Expression of active IK transcripts was significantly lower in ALL (51% positivity for IK2, and 58% positivity

15、 for IK1+IK2) than in controls (95% positivity) (P<0.05).3. In terms of positive expression of active IK transcripts (IK1+IK2), there were statistically significant differences among the three risk groups of ALL, with much lower percentage of expression positivity in high-risk ALL (37.5%) than th

16、at in standard risk (80%), medium risk (67%) or standard+medium risk (74%) ALL groups (P<0.05). Nevertheless, there existed no correlations between positive expression of each dominant-negative IK transcript and ALL risk categories. 4. Similarly, the ratio of positive expressions of active IK tra

17、nscripts (IK1+IK2) was significantly higher in prednisone good responder (71%) than that in prednisone poor responders (22%) (P<0.05), although no such differences were identified between the two ALL risk groups in terms of expression positivity of each dominant-negative IK transcript.5. For ALL

18、patients with initial WBC³50´109/L and WBC<50´109/L respectively, there were no significant differences of all IK transcripts except the dominant-negative IK 6 transcript. CONCLUSIONS: As to our best knowledge, this study reveals, for the first time in our country, that ALL display

19、s distinct overall expression pattern from that in normal control children. The findings that significantly less or absent expression of active IK transcripts in ALL as compared to normal control children, and that significantly less expression of active IK transcripts in some unfavorable ALL catego

20、ries (specifically, high risk ALL and prednisone poor responders ), suggest that IK might play very important roles both in the regulation of lymphopoiesis and leukemogenesis. KEY WORDS: Acute lymphoblastic leukemia (ALL); Ikaros zinc finger protein 1 (IKZF1); Nested RT-PCR; DNA sequencing; Expressi

21、on pattern; Children兒童急性淋巴細(xì)胞白血病IKZF1基因表達(dá)研究前 言白血病(leukemia)是兒童期最常見的惡性腫瘤，也是兒童最主要的死亡原因之一，嚴(yán)重危害兒童健康甚至生命，其中最常見的類型為急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)，約占75%80%。 近二十三年以來，兒童ALL的預(yù)后已得到很大改觀，長期無事件生存率(event-free survival, EFS)和總生存率(overall survival, OS)已分別達(dá)70%和80%以上1-4，兒童ALL已成為一種可治愈性疾病(curable disease)，而非

22、既往認(rèn)為的不治之癥(fatal disease)。盡管如此，仍有約20%左右的兒童ALL出現(xiàn)治療失敗(treatment failure)或復(fù)發(fā)(relapse)，這是目前兒童ALL治療中亟待解決的問題。 隨著基礎(chǔ)生命醫(yī)學(xué)科學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)了多種與白血病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的遺傳和環(huán)境因素，新型細(xì)胞遺傳學(xué)(cytogenetcics)、基因組學(xué)(genomics)和蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)等分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，揭示了傳統(tǒng)技術(shù)和方法難以發(fā)現(xiàn)的與白血病發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)的“細(xì)微異常”改變。但由于ALL是一組高度異質(zhì)性的惡性造血系腫瘤，目前仍未完全闡明其發(fā)病機(jī)制。既往大量研究已經(jīng)證

23、實，白血病的發(fā)病(leukemogenesis)與各種癌基因5、抑癌基因6和轉(zhuǎn)錄因子7等的異常表達(dá)密切相關(guān)，而且不同亞型可能涉及不同的信號傳導(dǎo)途徑。Ikaros家族鋅指蛋白1 (Ikaros family zinc finger 1, IKZF1)為一種極為重要的造血轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，屬鋅指蛋白家族成員，尤其在淋系造血(lymphopoiesis)方面發(fā)揮著關(guān)鍵性調(diào)控作用8-10。人類IKZF1基因定位于7p1211.12，其編碼的蛋白產(chǎn)物Ikaros與小鼠Ikaros蛋白同源性高達(dá)95%，具有高度的進(jìn)化保守性。由于IKZF1基因的“可變剪接”(alternative splicing)，至少具有

24、8種不同的可變剪接轉(zhuǎn)錄本(spliced transcripts)，從而相應(yīng)編碼8種蛋白異構(gòu)體(isoform)。不同轉(zhuǎn)錄本及其相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物Ikaros (IK)，簡稱為IK1IK8。IK具有高度的種屬進(jìn)化保守性和相似蛋白結(jié)構(gòu)。C端均具有1個共同的雙向性轉(zhuǎn)錄激活功能域(transcription activation motif)和2個鋅指結(jié)構(gòu)域(zinc finger domain)，后者與IK相互間形成雜(或純)二聚體以及與其他Ikaros家族蛋白(如Aliolos和Helios)的相互作用密切相關(guān)。但各種IK異構(gòu)體的差異主要表現(xiàn)在N端鋅指結(jié)構(gòu)(F1-F4)的組成及其DNA結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄

25、活性。IK至少必須具有3個N端鋅指結(jié)構(gòu)才具有與DNA結(jié)合的高親和力，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。IK1、IK2和IK3均具有3個以上的N-端鋅指結(jié)構(gòu)，它們表達(dá)于細(xì)胞核，屬于“功能性或活性IK異構(gòu)體”(functional or active IK isoforms)。IK4IK8因N端鋅指結(jié)構(gòu)少于3個而無DNA結(jié)合能力，并表達(dá)于胞漿，但可與功能性IK形成雜二聚體從而影響后者與DNA的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，發(fā)揮所謂“顯性負(fù)效應(yīng)”，因而被稱為“顯性負(fù)異構(gòu)體”（dominant negative isoforms）。 國外學(xué)者大量研究已經(jīng)充分表明，功能性IK及其與“顯性負(fù)”IK異構(gòu)體間的相互平衡制約，在維系

26、造血細(xì)胞尤其是淋巴細(xì)胞的分化和發(fā)育方面發(fā)揮著極為重要的調(diào)控作用，IK已被普遍認(rèn)為是淋系造血的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)分子（master transcriptional regulator）13.14。 IK異常表達(dá)也是白血病發(fā)生發(fā)展過程中極為常見的現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)，“顯性負(fù)”IK異構(gòu)體表達(dá)于各種白血病細(xì)胞株15、成人和兒童B系A(chǔ)LL、T系A(chǔ)LL和急性髓性白血病16-18。如小鼠因IK突變導(dǎo)致功能性IK無表達(dá)，或“顯性負(fù)”IK高表達(dá)，則快速發(fā)生白血病和淋巴瘤19。更為重要是，近年研究發(fā)現(xiàn)，“顯性負(fù)”IK異構(gòu)體在某些具有特定非隨機(jī)性細(xì)胞遺傳學(xué)/分子生物學(xué)異常的ALL表達(dá)明顯增高，如具有MLL基因重排的嬰兒AL

27、L、Ph+ALL等，并與這些ALL的不良預(yù)后、耐藥和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，高度提示IK異常表達(dá)也可能是反映和預(yù)測ALL長期預(yù)后的一個獨立不良預(yù)后因素20-26。 據(jù)文獻(xiàn)檢索，目前國內(nèi)關(guān)于IKZF的研究報道極少，僅查詢到一篇關(guān)于成人B系A(chǔ)LL患者Ikaros基因改變的會議摘要27。為了進(jìn)一步了解我國兒童ALL患者IKZF1基因的表達(dá)情況，尤其是IK與ALL患兒臨床常用預(yù)后危險因素的關(guān)系，我們借鑒國外相關(guān)文獻(xiàn)的方法，采用巢式PCR方法，檢測了43例兒童ALL患兒骨髓IKZF1基因各種可變剪接轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)情況，分析其與兒童ALL預(yù)后因素的相關(guān)關(guān)系。材料與方法一、 材料1. 主要試劑人淋巴細(xì)胞分離液中國醫(yī)學(xué)科

28、學(xué)院生物工程研究所Trizol試劑美國Invitrogen公司ReverTra Ace組合型逆轉(zhuǎn)錄試劑盒博瑞克生物技術(shù)有限公司2×Taq PCR Mastermix北京天根生物技術(shù)有限公司100bpDNA Maker天津生化科技北京有限公司三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇等國內(nèi)分析純產(chǎn)品DEPC美國sigma公司2. PCR引物的設(shè)計與合成根據(jù)NCBI基因庫(Genebank) IKZF1mRNA(NM_006060)和管家基因GAPDH mRNA序列(NM_002046)設(shè)計基因特異性引物, 由Invitrogen公司合成。為了提高擴(kuò)增特異性，對IKZF1基因采用巢式PCR擴(kuò)增，參照文獻(xiàn)

29、設(shè)計兩對引物28，而且兩對引物的上游和下游引物序列均分別對應(yīng)于IKZF1基因的第1號外顯子和第8號外顯子，從而保證能擴(kuò)增出全長IKZF1轉(zhuǎn)錄本(full length transcript)和可能出現(xiàn)的所有可變剪接轉(zhuǎn)變本(alternatively spliced transcripts)。具體如下:IZKF1基因第一輪PCR引物序列上游引物 F15-CAC-ATA-ACC-TGA-GGA-CCA-TG-3(20mer)下游引物 R15-AGG-GCT-TTA-GCT-CAT-GTG-GA-3(20mer)IZKF1基因第二輪PCR引物序列上游引物 F25-ATG-GAT-GCT-GAT-GA

30、G-GGT-CAA-GAC-3(24mer)；下游引物 R25-GAT-GGC-TTG-GTC-CAT-CAC-GTG-G-3(22mer)管家基因GAPDH引物序列上游引物 F35-GGA-AGG-TGA-AGG-TCG-GAG-T-3(19mer)下游引物 R35-TGA-GGT-CAA-TGA-AGG-GGT-C-3(19mer)3. 主要儀器KDC-1042低速離心機(jī)科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司Eppendorf-5108冷凍離心機(jī)德國Eppendorf公司HC-2516高速離心機(jī)科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司DU730紫外可見光分光光度計美國Beckman Coulture公司C-

31、100 Thermal cycler美國Bio-Rad公司Universal凝膠圖像分析系統(tǒng)美國Bio-Rad公司電子天平上海精密科學(xué)儀器有限公司 二、 研究對象實驗組：系我院(四川大學(xué)華西婦產(chǎn)兒童醫(yī)院)兒童血液腫瘤科2007年至2009年收治的新診ALL患兒43例，年齡1.215歲，平均年齡8.15歲。其中男性29例，女性14例。根據(jù)我國兒童ALL診治標(biāo)準(zhǔn)，主要依據(jù)骨髓形態(tài)學(xué)和免疫表型檢查結(jié)果明確診斷。根據(jù)年全國協(xié)作組診治方案所定臨床危險組劃分標(biāo)準(zhǔn)，本組AL患兒包括標(biāo)危組 15例、中危組12例、高危組16例；潑尼松敏感組31例，潑尼松不敏感9例；初診外周血WBC³50´1

32、09/L者14例，初診外周血WBC<50´109/L 29例；對照組：為我院兒童保健科門診定期常規(guī)體檢的20名健康兒童，年齡113歲(平均年齡：5.1±2.9歲)，其中男性10例，女性10例。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組和對照組兒童年齡(P=0.052)和性別(P=0.334)分布無統(tǒng)計學(xué)顯著差異。三、 研究方法1. 標(biāo)本采集 ALL患兒初診時骨髓標(biāo)本的采集：經(jīng)擬診ALL患兒的法定監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書后，進(jìn)行骨髓穿刺檢查，收集患者骨髓標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)等診斷必須的檢查，額外的骨髓標(biāo)本用于本實驗。每份抗凝骨髓標(biāo)本約12ml。共43份。4小時內(nèi)分離骨髓單個核細(xì)胞(具體方法下述)，-2

33、0°C條件下保存?zhèn)溆谩?健康兒童EDTA抗凝外周血標(biāo)本的采集：收集于我院兒童保健門診進(jìn)行常規(guī)體檢(包括血液常規(guī)檢查)的健康兒童外周血標(biāo)本12ml，EDTA抗凝，4小時內(nèi)分離單個核細(xì)胞(具體方法下述)，-20°C條件下保存?zhèn)溆?，?0份。2. 淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法提取制備單個核細(xì)胞 將新鮮收集的外周血或骨髓抗凝標(biāo)本12ml，加入等量DEPC處理的PBS(0.01mM)緩沖液稀釋； 于10ml滅菌離心管內(nèi)加入適量淋巴細(xì)胞分離液，然后沿離心管壁小心PBS稀釋的抗凝標(biāo)本，室溫下20002500rpm離心20分鐘。 離心后用巴氏吸管小心吸取第二層乳白色單個核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至另一

34、滅菌去酶刻度離心管，DEPC處理的PBS緩沖液清洗后離心5分鐘(1500rpm)。 單個核細(xì)胞沉淀(cell pellet)中加入1ml Trizol試劑，反復(fù)吹打直至細(xì)胞沉淀充分融化，然后將單個核細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5ml Eppendorf微量離心管，靜置數(shù)分鐘后于-20°C保存?zhèn)溆谩?. 單個核細(xì)胞總RNA 的提取制備：采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，按照試劑說明書進(jìn)行。具體過程簡述如下： 將溶解于Trizol試劑的單個核細(xì)胞室溫下靜置56分鐘，然后加入200ml氯仿，劇烈震蕩混勻，室溫下靜置23分鐘； 離心15分鐘(4°C，12000rpm)后，小心吸取上層水相

35、轉(zhuǎn)移至另一EP管，加入500l異丙醇，輕輕震蕩混勻，室溫下靜置10分鐘； 再次離心10分鐘(4°C，12000rpm)，可見管底少量膠狀沉淀； 棄上清，用DEPC水配制的75%乙醇洗滌RNA沉淀；然后離心5分鐘(4°C，7500rpm)； 然后烘干提取制備的細(xì)胞總RNA(50°C60°C)，并用DEPC處理的水溶解RNA，分裝后-70°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?取2ml RNA樣品，紫外分光光度計內(nèi)測定RNA的純度及濃度。4. 逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA采用ReverTra Ace組合型逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(博瑞克公司產(chǎn)品)逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，按試劑盒說明書操作，具

36、體如下反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：制備的cDNA于-20°C 條件下保存?zhèn)溆?。試劑每一反?yīng)體系中的加樣量 (ml)5´RT Buffer4dNTP Mixture 2Super RI0.5RT-Enhancer0.5oligo(dT)18(50pmol/l)1RNA模板(<1g)XReverTra Ace1RNase Free H2O11-XTotal Volume20逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42°C40分鐘5. 管家基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)驗證逆轉(zhuǎn)錄是否成功 采用2×Taq PCR Mastermix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，總反應(yīng)體積2

37、5ml。具體如下：試劑每一反應(yīng)體系中的加樣量 (ml)2×Taq PCR Mastermix12.5上游引物(10Mm)1下游引物(10Mm)1cDNA模板XddH2o10.5-X總反應(yīng)體積25首先進(jìn)行管家基因的PCR反應(yīng)，如出現(xiàn)預(yù)期的清晰單一PCR擴(kuò)增條帶，表明逆轉(zhuǎn)錄成功，制備的cDNA可用于IKZF1目標(biāo)基因的巢式PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性3分鐘，然后95°C 30秒，58°C30秒，72 30秒，共30個循環(huán)，最后72°C 5分鐘。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5ml加樣于2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(電壓120V

38、)后，然后采用凝膠圖像分析儀進(jìn)行電泳圖像采集和分析。6. 巢式PCR檢測IZKF1基因表達(dá)情況為了提高IZKF1基因的擴(kuò)增特異性，采用對應(yīng)于IZKF1基因的第1號外顯子和第8號外顯子的兩對引物進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，保證能擴(kuò)增出全長IZKF1轉(zhuǎn)錄本和可能出現(xiàn)的所有可變剪接轉(zhuǎn)變本。第一輪PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件于0.2ml無菌薄壁PCR反應(yīng)管中加入2l cDNA模板進(jìn)行巢樣式PCR第一輪反應(yīng)，具體反應(yīng)體系如下：反應(yīng)體系l/管cDNA模板2上游引物 F1(10pmol/L)1下游引物 R1 (10pmol/L)12*Taq Master Mix12.5ddH208.5總反應(yīng)體積25第一輪巢式PCR的反

39、應(yīng)條件為：首先于95°C變性5分鐘， 95°C30秒；60°C45秒；72°C30秒；然后進(jìn)行35個PCR循環(huán)，最后72°C終延伸5分鐘。第二輪PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件取第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物0.5l與9.5l ddH20混合（稀釋20倍），然后從中吸取1l作為第二輪PCR反應(yīng)的模板，具體反應(yīng)體系如下：反應(yīng)體系l/管cDNA模板1上游引物 F1(10pmol/L)1下游引物 R1 (10pmol/L)12*Taq Master Mix12.5ddH209.5總反應(yīng)體積25第二輪巢式PCR的反應(yīng)條件為：首先于95°C變性5分鐘，然后進(jìn)行3

40、5個PCR循環(huán)，95°C30秒；62°C45秒；72°C30秒；最后72°C終延伸5分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物同樣于2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(電壓120V)和凝膠圖像分析。7. DNA測序為了驗證是否真正擴(kuò)增出了全長IKZF1轉(zhuǎn)錄本及其多種可變剪接轉(zhuǎn)錄本，從瓊脂糖凝膠上剪切下與對應(yīng)于IKZF1各種轉(zhuǎn)錄本大小的清晰電泳條帶，分別純化后送天根生化科技(北京)有限公司進(jìn)行DNA測序，并要求對大片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序。DNA測序結(jié)果經(jīng)NCBI BLASTN在線軟件進(jìn)行比對和驗證。四，統(tǒng)計分析采用卡方檢驗比較組間或多組間IK陽性表達(dá)率，以P<0.05作為判斷有無統(tǒng)

41、計學(xué)顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié) 果一、 RNA純度和完整性的檢測采用分光光度計檢測提取制備的RNA樣品OD值。如OD260/OD280介于1.62.0，表明提取制備的RNA純度較好。將RNA樣品于1%瓊脂糖凝膠電泳(電壓130V) 20分鐘，可見28S、18S和5S三條清晰明亮的條帶(圖1)，表明提取制備的RNA無明顯降解及污染，純度較高。圖1.部分標(biāo)本RNA電泳圖二、 普通PCR驗證逆轉(zhuǎn)錄是否成功采用GAPDH管家基因特異性引物和上述方法部分所述反應(yīng)體系和條件，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增反應(yīng)，驗證逆轉(zhuǎn)錄是否成功。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果檢測出對應(yīng)于預(yù)期大小的單一清晰條帶，證實逆轉(zhuǎn)錄成功，

42、制備的cDNA可用于目標(biāo)基因IKZF1的巢式PCR反應(yīng)。圖2. 部分標(biāo)本GAPDH管家基因普通PCR擴(kuò)增結(jié)果三、 IKZF1基因巢式RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果按方法部分所述反應(yīng)體系和條件，分別以兩對IKZF1基因特異性引物進(jìn)行兩輪PCR反應(yīng)，檢測IKZF1基因表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 健康對照兒童外周血單個核細(xì)胞表達(dá)各種IKZF1可變剪轉(zhuǎn)錄本，包括顯性負(fù)轉(zhuǎn)錄本。從圖3可以比較直觀地發(fā)現(xiàn)，健康對照兒童外周血單個核細(xì)胞表達(dá)的IKZF1轉(zhuǎn)錄本中，IK2表達(dá)水平最高并表達(dá)于所有20例對照組外周血單個核細(xì)胞(除對照8)，提示IKZF1基因編碼的野生型Ikaros蛋白（如IK2）在正常造血方面具有重要調(diào)節(jié)作用，而顯

43、性負(fù)異構(gòu)體的表達(dá)可能也發(fā)揮著重要的平衡制約調(diào)節(jié)作用。圖3.部分健康對照組兒童外周血單個核細(xì)胞IKZF1表達(dá)情況 43例ALL患兒骨髓單個核細(xì)胞也表達(dá)IKZF1各種可變剪接轉(zhuǎn)錄本，但不同ALL患兒IKZF1可變剪接轉(zhuǎn)錄本表達(dá)情況差異很大，部分患兒以IK6和IK8等顯性負(fù)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)為主(圖4)。ALL患兒IKZF1基因表達(dá)情況或可變剪接本的表達(dá)譜(expression pattern)與健康對照兒童具有很大的差異，進(jìn)一步印證了國外學(xué)者的研究報道，高度提示IKZF1基因的異常表達(dá)(顯性負(fù)轉(zhuǎn)錄本編碼的Ikraos異構(gòu)體蛋白)與白血病發(fā)病可能具有極為密切的關(guān)系。圖4. 部分ALL患兒骨髓單個核細(xì)胞IKZ

44、F1表達(dá)情況四、 DNA測序結(jié)果為了驗證是否真正擴(kuò)增出了各種IKZF1可變剪接轉(zhuǎn)錄本，我們選擇了與各種可變剪接轉(zhuǎn)錄本預(yù)期大小對應(yīng)的6種第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，經(jīng)NCBI BLASTN在線軟件進(jìn)行了比對和驗證，并根據(jù)IKZF1 mRNA (NM_006060)全長序列和外顯子位置進(jìn)行分析判斷。測序結(jié)果證實，我們送檢的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之一包含IKZF1基因第2號外顯子的部分序列、外顯子37的所有序列，以及對應(yīng)于第8號外顯子5-端的部分序列(設(shè)計的IKZF1基因特異性下游引物序列正好對應(yīng)于這段序列)，相似性達(dá)99%，從而證實為IK1 (圖5，圖6)。同樣方法證實，其他第二輪PCR產(chǎn)物分別為IK2

45、、IK4、IK6和IK8。圖5：第二輪PCR產(chǎn)物之一測序結(jié)果圖6：第二輪PCR產(chǎn)物測序后Blast Search結(jié)果表明與IZKF1 mRNA序列同源性高達(dá)99%五、 研究對象單個核細(xì)胞IKZF1基因表達(dá)情況根據(jù)正常對照兒童外周血單個核細(xì)胞和ALL患兒骨髓單個核細(xì)胞IKZF1各種可變剪接表達(dá)本的電泳條帶位置，結(jié)合測序結(jié)果，確定IKZF1基因各種可變剪接本的表達(dá)情況。標(biāo)本陽性表達(dá)IK剪接本標(biāo)本陽性表達(dá)IK剪接本4ik1+ik212ik2+ik4+ik65ik1+ik2+ik413ik2+ik4+ik66ik1+ik2+ik49ik2+ik4+ik67ik1+ik2+ik417ik2+ik4+ik

46、61ik1+ik2+ik4+ik82ik2+ik4+ik83ik1+ik2+ik4+ik810ik2+ik4+ik811ik2+ik418ik2+ik4+ik815ik2+ik419ik2+ik4+ik816ik2+ik420ik2+ik4+ik8+ik614ik2+ik68ik8+ik4表1. 20名健康對照兒童外周血單個核細(xì)胞IKZF1基因表達(dá)情況 從上表也可看出，除第8例對照兒童外，所有對照兒童外周血單個核細(xì)胞均表達(dá)IK1和或IK2；除第4例對照兒童外，所有對照兒童也均表達(dá)顯性負(fù)可變轉(zhuǎn)錄本IK4和或IK6和或IK8。病例編號陽性表達(dá)IK轉(zhuǎn)錄本病例編號陽性表達(dá)IK轉(zhuǎn)錄本病例編號陽性表達(dá)IK

47、轉(zhuǎn)錄本72IK199IK2+IK4+IK82IK4A10IK1107IK2+IK4+IK896IK4A+IK636IK180IK2+IK4+IK897IK4+IK678IK2100IK2+IK4+IK8+IK686IK4+IK61IK261IK2+IK4+IK8+IK694IK4+IK889IK1+ik276IK2+IK4+IK8+IK648IK695IK1+ik679IK2+IK4+IK8+iIK664IK693IK1+IK2+IK463IK2+IK4+IK8+IK669IK6101IK2+ik4104IK2+IK4+IK8+IK692IK6105IK2+ik460IK2+IK4+IK8+I

48、K659IK6103IK2+IK415IK4A90IK691IK2+ik465IK450IK6+IK868IK2+ik6106IK4A70IK871IK2+IK4+IK881IK882IK8102IK2+IK4+IK8表2 43名兒童ALL患者骨髓單個核細(xì)胞IKZF1基因表達(dá)情況結(jié)合圖4和表2，可以比較直觀地發(fā)現(xiàn)，多數(shù)ALL患兒表達(dá)各種“顯性負(fù)”IK轉(zhuǎn)錄本，部分患兒甚至僅表達(dá)一種或多種“顯性負(fù)”IK轉(zhuǎn)錄本，這與健康對照兒童IK表達(dá)譜存在顯著差異。六、 不同預(yù)后因素ALL患兒IK轉(zhuǎn)錄本陽性表達(dá)率分析為了了解IK可變剪接轉(zhuǎn)錄本(尤其是顯性負(fù)轉(zhuǎn)錄本)與ALL各種臨床危險因素間的關(guān)系，進(jìn)行了如下統(tǒng)計學(xué)

49、分析。(一)、ALL與對照組功能性IK和顯性負(fù)IK轉(zhuǎn)錄本表達(dá)率比較1、ALL患兒與健康對照兒童IK1陽性表達(dá)率的比較：分別統(tǒng)計ALL組和對照組IK1陽性表達(dá)的例數(shù)，而無論其他IK可變轉(zhuǎn)錄本是否表達(dá)，統(tǒng)計結(jié)果表明兩組間IK1陽性表達(dá)率無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(2=0.84；P>0.05)。分組IK1陽性表達(dá)(例)IK1陰性表達(dá)(例)合計(例)正常對照61420ALL患兒73643合計1350632、ALL患兒與健康對照兒童IK2陽性表達(dá)率的比較：分別統(tǒng)計ALL組和對照組IK2陽性表達(dá)的例數(shù)，而無論其他IK可變轉(zhuǎn)錄本是否表達(dá)，統(tǒng)計結(jié)果表明兩組間IK2陽性表達(dá)率存在統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(2=11.54；

50、P<0.05)。分組IK2陽性表達(dá)(例)IK2陰性表達(dá)(例)合計(例)正常對照19120ALL患兒222143合計4122633、ALL患兒與健康對照兒童功能性IK (IK1+IK2)陽性表達(dá)率的比較：根據(jù)前言部分可知，IK1和IK2均為功能性或活性IK可變轉(zhuǎn)錄本，因此我們將兩者合并統(tǒng)計，比較ALL和對照組(IK1+IK2)陽性表達(dá)率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在統(tǒng)計學(xué)差異(2=6.01；P<0.05)。分組(IK1+IK2)陽性(例)(IK1+IK2)陰性(例)合計(例)正常對照19120ALL患兒251843合計4419634、ALL患兒與健康對照兒童IK4陽性表達(dá)率的比較：同樣方法統(tǒng)計結(jié)果表

51、明兩組間IK4陽性表達(dá)率具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(2=9.56；P<0.05)。分組IK4陽性表達(dá)(例)IK4陰性表達(dá)(例)合計(例)正常對照18220ALL患兒212243合計4024635、ALL患兒與健康對照兒童IK6陽性表達(dá)率的比較：同樣方法統(tǒng)計結(jié)果表明兩組間IK6陽性表達(dá)率無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(2=1.67；P>0.05)。分組IK6陽性表達(dá)(例)IK6陰性表達(dá)（例）合計（例）正常對照51520ALL患兒182543合計2340636、ALL患兒與健康對照兒童IK8陽性表達(dá)率的比較：同樣方法統(tǒng)計結(jié)果表明兩組間IK8陽性表達(dá)率無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(2=0；P>0.05)。分組

52、IK8陽性表達(dá)(例)IK8陰性表達(dá)(例)合計(例)正常對照81220ALL患兒172643合計2538637、ALL患兒與健康對照兒童顯性負(fù)IK陽性表達(dá)率的比較：我們首先匯總具有一種或一種以上顯性負(fù)IK表達(dá)的研究對象，然后比較ALL患兒組與健康對照兒童組是否存在差異。同樣方法統(tǒng)計結(jié)果表明兩組間所有顯性負(fù)IK陽性表達(dá)率無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異(2=0.386；P>0.05)。分組顯性負(fù)IK陽性表達(dá)(例)顯性負(fù)IK陰性表達(dá)(例)合計(例)正常對照19120ALL患兒37643合計56763(二)、不同臨床危險度ALL患兒IK轉(zhuǎn)錄本表達(dá)情況分析 為了進(jìn)一步探討功能性IK轉(zhuǎn)錄本和顯性負(fù)IK轉(zhuǎn)錄本與ALL各種臨床危險因素的關(guān)系，我們分別比較了不同預(yù)后因素ALL組間功能性IK轉(zhuǎn)錄本和顯性負(fù)IK轉(zhuǎn)錄本陽性表達(dá)率，結(jié)果如下：1、 不同臨床危險度ALL組間IK1陽性表達(dá)率的比較：結(jié)果表明組間無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異（2=0.516；P&