廣東地區(qū)丙型肝炎患者的HCV基因分型研究

1、廣東地區(qū)丙型肝炎患者的HCV基因分型研究    摘要nbsp;目的：了解廣東地區(qū)慢性丙型肝炎患者的HCV基因分型情況，為丙型肝炎病毒的診斷和預防提供有力依據(jù)。方法:nbsp;根據(jù)丙型肝炎病毒RNA全序列,在5-NCR區(qū)設計引物，通過套式PCR擴增     胡斌1 張孝文2 程鋼1 何蘊韶1 勞紹賢3 （ 1 中山大學達安基因診斷中心,廣州，510089 2.中山大學附屬第三醫(yī)院，廣州，510630 3.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,廣州，510405) 作者簡介：胡斌，男，1970年10月出生，碩士，講師，從事專業(yè)為

2、分子生物學與基因診斷。 摘要 目的：了解廣東地區(qū)慢性丙型肝炎患者的HCV基因分型情況，為丙型肝炎病毒的診斷和預防提供有力依據(jù)。方法: 根據(jù)丙型肝炎病毒RNA全序列,在5-NCR區(qū)設計引物，通過套式PCR擴增，特異性產(chǎn)物測序分析并分型。結(jié)果：檢測HCV感染樣本58例，擴增出陽性樣本47例，共檢出3種基因型，分別為1b,2a和4型，其中1b占85.1，2a占12.8，4型占2.1，4型為中國人群中極少報道被檢出的罕見型。結(jié)論：廣東地區(qū)HCV基因型主要為1b型，其次為2a型，與中國其它地區(qū)HCV基因型分布比較一致。 關鍵詞：丙型肝炎病毒，套式RT-PCR，測序，基因分型 The study of t

3、he genotyping of Hepatitis C Virus in Guangdong Hu Bin1 Zhang Xiaowen2 Cheng Gang1 He Yunshao1 Lao Shaoxian3 1 DA AN Gene Diagnostic Center OF Sun Yat-sen University,Guangzhou 2 The third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou 3 First Affiliated Hospital of Guangzhou University of T

4、raditional Chinese Medicine Abstract Object To investigate the prevalent condition of Hepatitis C Virus(HCV) in Guangdong for giving the powerful proof in the diagnosis and precaution of HCV. Method The primer in the domain of 5-NCR was designed and the nested PCR product was detected through revers

5、e transcription polymerase chain reaction . The genetype of HCV was determined by the results of the saquences.Result 58 samples were detected and three kinds of genotype' including 1b(85.1%),2a(12.8%) and 4 (2.1%)were found in 47 positive samples. Conclusion The main genotype of HCV in Guangdon

6、g is HCV1b followed by HCV 2a.The prevalent strains of HCV in Guangdong compared with other districts in China is approximately identical. Key words Hepatitis C;PCR;Genetype; 丙型肝炎病毒（HCV）感染和輸血后肝炎密切相關，大部分HCV患者會逐步演變?yōu)槁愿腥?，并根?jù)病程輕重發(fā)展為肝硬化或肝癌。HCV病毒基因有較強的變異性，變異位點可發(fā)生在基因組的各個區(qū)域，根據(jù)變異位點的不同將HCV分為不同型別。由于HCV的感染嚴重程度和

7、預后均與其分型關系密切，本研究擬通過分析部分廣東地區(qū)的慢性丙肝患者體內(nèi)HCV病毒分型情況，為熱帶地區(qū)丙型肝炎病毒的臨床診斷和疾病預防提供一定的實驗依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 標 本 HCV RNA 陽性病人血清收集于中山大學附屬第三醫(yī)院，共50例病人。取2ml EDTA抗凝全血后分離血清，70凍存?zhèn)溆谩?1.2 儀 器 ABI 3900臺式高通量DNA合成儀為美國應用生物系統(tǒng)公司（ABI）產(chǎn)品。 WATERS 600 高壓液相色譜儀為美國WATERS公司產(chǎn)品。 PE 9600型全自動PCR儀為美國應用生物系統(tǒng)公司（ABI）產(chǎn)品。 1.3 試 劑 套式PCR引物由中山大學達安基因診斷中心合成

8、并純化，逆轉(zhuǎn)錄試劑購自德國QIAGEN公司，PCR檢測試劑是中山大學達安基因診斷中心產(chǎn)品。 1.4 方 法 1.4.1 提取核酸 采用異硫氰酸胍（TRIZOL）一步法抽提血清中游離病毒RNA, 75%乙醇洗滌RNA沉淀，DEPC處理水溶解RNA，-80保存?zhèn)溆谩?1.4.2 套式RT-PCR擴增 1.4.2.1引物設計合成：引物根據(jù)HCV病毒RNA的全長序列設計，設計區(qū)域選擇HCV RNA 5-NCR區(qū)，計算機輔助設計軟件為PrimerExpress 2.0，引物由中山大學達安基因診斷中心的ABI 3900臺式高通量DNA合成儀合成并經(jīng)過高壓液相色譜儀純化，序列如下: 外擴增上游引物F1: 5

9、-ACTCCACCATAGATCACTCC-3 外擴增下游引物R1: 5-GAACTTAACGTCCTGTGGGC-3 內(nèi)擴增上游引物F2: 5-CTGTCTTCACGCAGAAAGCG-3 內(nèi)擴增下游引物R2: 5- ACCCTATCAGGCAGTACCAC -3 1.4.2.2 cDNA合成：取模板RNA 5ul，5×緩沖液5ul，dNTPs lmM,引物R1 20pmol，逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV200u，RNasin 20u(Promega)，加DEPC水補足至25ul，混勻，37孵育1小時，955min后，-70保存。 1.4.2.3 套式PCR外擴增：取上述cDNA 5ul進行

10、PCR擴增，5×緩沖液10ul，引物F1及R1各25pmol,dNTPs200 umol,MgCl2 1.5mM,Taq酶2.5u,加ddH2O補充至50 ul，用滅菌石臘油覆蓋液面，置PE 9600 型全自動PCR儀94預變性7分鐘后，再依次25個循環(huán)，每次循環(huán)條件為93 1分鐘，54 50秒，72 1分鐘，最后72延伸10分鐘，得到外擴增PCR產(chǎn)物。 1.4.2.4 套式PCR內(nèi)擴增：取上述外擴增PCR產(chǎn)物5ul為模板，5×緩沖液10 ul，引物F2及R2 各25pmol,dNTPs 200umol, MgCl2 1.5mM,Taq酶2.5u,加ddH2O至50ul，用

11、滅菌石臘油覆蓋液面，置PE 9600 型全自動PCR儀94預變性7分鐘后，再依次循環(huán)35次，每次循環(huán)條件為93 1分鐘，55 1分鐘，72 1分鐘，最后72延伸10分鐘，得到內(nèi)擴增PCR產(chǎn)物，整個實驗過程均設置陰性及陽性對照。 1.4.3 HCV基因測序分型 內(nèi)擴增PCR產(chǎn)物全長245bp,2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，PCR產(chǎn)物直接送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序。根據(jù)每個樣本的測序結(jié)果進行HCV基因分型。 2 結(jié) 果 實驗共58份血清標本，PCR產(chǎn)物測序共得到陽性結(jié)果47例，其中1b型40例(85.1%)，測序圖略；2a型6例(12.8%)，測序圖略；4型1例(2.1%)，其部分測序圖譜

12、見圖2，箭頭標注處表示此位點堿基由其它型別的C變異為T。 3 討 論 丙型肝炎病毒(HCV)基因組為一條線性正鏈單股RNA，長約9.5Kb，主要由5及3端非編碼區(qū)（NCR）和一個大的單一開放讀碼框架（ORF）組成1。HCV基因容易發(fā)生變異，變異可產(chǎn)生于全基因序列的各個區(qū)域2。由于HCV基因的變異性較大，客觀上存在很多的型別，給臨床的診斷帶來一定的難度。根據(jù)其基因序列進行分型，可從分子生物學的角度對HCV的高變異性增加更多的認識，對進一步研究HCV病毒的流行病學規(guī)律，為丙型肝炎的臨床診斷和治療方法的改進提供更多的依據(jù)。NCR區(qū)為基因的保守序列，Simmonds 根據(jù)HCV的5-NCR區(qū)序列的差異

13、，建立了HCV基因組序列分型法，將HCV分為6種基因型和31多種亞型3。在此分型方法的基礎上，目前已報道的基因型有11個，基因亞型超過70種4。 HCV病毒主要通過輸血和血液制品傳播，與慢性肝炎和肝癌的發(fā)生有密切關系5。HCV病毒分型具有一定的地域性，1a多見于歐美地區(qū)，1b和2a型在亞洲地區(qū)分布廣泛，4型多分布于印度、北非及中東地區(qū)3，6，我國多見1b、2a型7，8。本研究收集了廣東地區(qū)慢性丙型肝炎患者58例，用高靈敏度的套式RT-PCR方法擴增病毒RNA并通過測序鑒定，檢測了患者血清中HCV的分型情況，共擴增出陽性樣本47例，結(jié)果表明所檢測患者共有3種HCV基因型的分布，分別為1b,2a和

14、4型，其中1b占85.1，2a占12.8，4型占2.1，1b為主要的流行型別，與中國其它地區(qū)HCV的研究報道結(jié)果比較一致7，8。從目前國內(nèi)的研究結(jié)果來看，基本沒有HCV4型的報道，4型主要在中東及周邊地區(qū)流行。廣東地區(qū)作為對外開放的前沿陣地，隨著國際交流的增多，大量外籍人士定居此地，是HCV 4型在本地出現(xiàn)的重要外在因素。這種病毒流行趨勢的改變是一個長期的漸進的過程，應該引起本地疾病控制和流行病監(jiān)測部門的高度重視，當然也不排除病毒株自身基因突變的可能。 作為HCV分型最準確可靠的方法，本研究采用套式RT-PCR方法擴增特異性HCV基因片段，進行核苷酸序列測定分析確定基因型別，研究了部分廣東地區(qū)

15、HCV病人的病毒基因分型情況，從分子生物學的角度初步反映了該地區(qū)HCV病毒的型別分布。由于本研究收集樣本的數(shù)量有限，進一步的結(jié)果尚有待與相關流行病調(diào)查機構(gòu)和醫(yī)院展開科研合作，為HCV所致肝炎的疾病控制和診斷治療提供更多的實驗依據(jù)。 參考文獻 1 路福興，藏雋編譯。丙型肝炎流行病學。國外醫(yī)學（病毒學分冊），1998，5（4）：109111 2 張永祥。丙型肝炎病毒基因分型及其臨床意義的研究進展。國外醫(yī)學（流行病學傳染病學分冊），1998，25（2）：53 3 P.Simmonds,F.McOmish,P.L.Yap,S.-W.Chan,et al.Sequence variability in

16、the 5-non-coding region of hepatitis C virus: identification of a new virus type and restrictions on sequence diversity.Journal of General Virology,1993,74:661-668 4 Liew M,Erali M,Page S,et al.Hepatitis C genotyping by denaturing high-performance liquid chromatography.Clin Microbiol,2004,42(1):158 5 Saito I, Miyamura T, Ohbayashi A, Harada H, Katyama T, et al. Hepatitis C virus infection is associated with the development of hepatocellular carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA