生黑醋酸桿菌山梨醇高濃度發(fā)酵的培養(yǎng)特性

1、生黑醋酸桿菌山梨醇高濃度發(fā)酵的培養(yǎng)特性荊士華1,2,汲涌2,陳宏權(quán)2,姜銘妍2,諶明2,楊偉超1,張海宏2,徐慧13(1.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所,遼寧沈陽110016;2.東北制藥總廠,遼寧沈陽110026摘要調(diào)節(jié)生黑醋酸桿菌的代謝特性,實(shí)現(xiàn)其在高濃度山梨醇下的發(fā)酵。改變發(fā)酵所用種液的培養(yǎng)特性以及在發(fā)酵中期補(bǔ)加山梨醇。在搖瓶培養(yǎng)條件下,通過上述方法可以將Vc一步發(fā)酵中底物山梨醇的濃度從23%提高到38%,培養(yǎng)30h時(shí)發(fā)酵率達(dá)95%,山梨糖產(chǎn)量達(dá)360mg/mL。在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下山梨糖的發(fā)酵產(chǎn)率得到明顯提高。關(guān)鍵詞發(fā)酵;山梨醇;山梨糖;高濃度;種液中圖分類號Q93文獻(xiàn)標(biāo)識碼B文章編號1

2、005-7021(200904-0103-04The fe rm en ta ti on character istic of G luconbacter m elanogenus i n m ed ium w ith h i gh concen tra ti on of D2sord ibo l J ING Shi2hua1,2,J I Yong2,CHE N Hong2quan2,J IANG M ing2yan2,CHE N M ing2,Y ANG W ei2chao1,ZHANG Hai2hong2,XU Hui1(1.Institute of A pplied Ecology,Ch

3、inese A cade m y of Sciences Shenyang,110016;2.N ortheast General Phar m aceutical Factory L iaoning Shenyang,110026AbstractTo contr ol the characteristic of Gluconbacter m elanogenus in mediu m with high concentrati on of D2s ordibol (38%.Experi m ents were i m p lemented by adding D2s orbit ol dur

4、ing fer mentati on and changing innoculiu m.The re2 sults showed that the strain could be cultured well in mediu m containing D2s orbit ol fr om23%t o38%.The conversi on rate of D2s orbit ol t o L2s orbose in mediu m with38%D2s orbit ol was95%after fer mentati on for30hour.Pr oductivity of s orbose

5、was i m p r oved notably under op ti m ized conditi ons.KeywordsFer mentati on;S orbit ol;Sorbose;I nnoculiu m維生素C(V ita m in C,Vc在醫(yī)藥和臨床方面都具有重要的應(yīng)用價(jià)值,亦廣泛用于食品工業(yè)和化妝品工業(yè)3,4。目前工業(yè)上主要用萊氏法1和兩步發(fā)酵法2生產(chǎn)Vc,此兩種方法初始均經(jīng)發(fā)酵將D2山梨醇轉(zhuǎn)化為L2山梨糖5,6。發(fā)酵中山梨醇投料濃度為23%左右,近期,德國巴斯夫等公司將山梨醇投料濃度提高達(dá)50%以上。為提高生產(chǎn)率,實(shí)現(xiàn)山梨醇高濃度發(fā)酵,根據(jù)生黑醋酸桿菌的生長特性,采用

6、發(fā)酵中途補(bǔ)醇及改變發(fā)酵種液的方法,研究了生黑醋酸桿菌在高底物濃度中的培養(yǎng)特性及山梨醇轉(zhuǎn)化效率。1材料與方法1.1材料1.1.1菌株生黑醋酸桿菌Gluconbacter m elano2 genus(簡稱黑醋菌,由東北制藥總廠Vc公司提供。1.1.2試劑D2山梨醇:東北制藥總廠自制;葡萄糖:沈陽化學(xué)試劑廠生產(chǎn),分析純;酵母膏:廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;玉米漿、碳酸鈣由東北制藥總廠Vc公司生產(chǎn)車間提供;硫酸銅:沈陽新興試劑,分析純;丙三醇:沈陽新興試劑廠,分析純;瓊脂:青島海燕牌。作者簡介:荊士華女,碩士研究生,高級工程師。研究方向?yàn)樯锇l(fā)酵。E2mail:jingshhs 3通訊作者。Tel:

7、024*,E2mail:xuhui收稿日期:2008209217;修回日期:2009204221301微生物學(xué)雜志2009年7月第29卷第4期JOURNAL OF M I CROB I O LOGY July2009Vol.29No.41.1.3培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù),%分離培養(yǎng)基:葡萄糖10,酵母膏0.7,碳酸鈣1,瓊脂2.5;發(fā)酵培養(yǎng)基:D2山梨醇2335,玉米漿0.2,酵母膏0.04,碳酸鈣0.07。1.1.4儀器721分光光度計(jì),上海第三分析儀器廠;PHS22F pH計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司。1.2方法1.2.1黑醋菌生長曲線的測定A600值光密度測定法7。1.2.2種液制備選擇不同培養(yǎng)

8、階段(12、14、16h的35%山梨醇濃度發(fā)酵液,作種液。1.2.3搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)各種液以20%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(180mL發(fā)酵培養(yǎng)基/750mL三角瓶,32,250r/m in培養(yǎng),不同時(shí)間取樣,測山梨糖濃度、pH值。1.2.4補(bǔ)醇培養(yǎng)初始發(fā)酵投山梨醇量為23%,發(fā)酵10h后補(bǔ)加山梨醇至所設(shè)計(jì)濃度。1.2.5分析方法甘油酮測糖法8。2結(jié)果與分析2.1黑醋菌在不同山梨醇濃度下的生長特性采用分光光度法檢測黑醋菌在不同山梨醇濃度下的生長曲線,結(jié)果見圖1。由圖1可知,23%山梨醇投料時(shí),菌體在培養(yǎng)810h時(shí)為對數(shù)生長期,在培養(yǎng)10h后進(jìn)入穩(wěn)定期。35%投山梨醇時(shí),菌體在培養(yǎng)1012h時(shí)為對數(shù)生長

9、期。2.2發(fā)酵過程中補(bǔ)醇對黑醋菌產(chǎn)糖的影響不同山梨醇濃度發(fā)酵,山梨醇一次性投入和分批投入,效果不一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。由表1及表2可以看出,30%山梨醇濃度下發(fā)酵,發(fā)酵中期補(bǔ)加山梨醇組較一次投醇效果好,但優(yōu)勢不明顯;35%山梨醇濃度發(fā)酵,發(fā)酵中期補(bǔ)加山梨醇組較一次投醇效果好,山梨糖產(chǎn)量提高達(dá)8%。2.335%山梨醇濃度發(fā)酵終點(diǎn)醪液做種液接種時(shí)對發(fā)酵的影響采用35%山梨醇濃度發(fā)酵終點(diǎn)醪液做種液,測定了對黑醋菌發(fā)酵的影響。由表3可知,以35%山梨醇濃度發(fā)酵終點(diǎn)醪液做種液效果最好,最高30h產(chǎn)山梨糖360mg/mL,而同樣條件下的生產(chǎn)種液32h產(chǎn)山梨糖僅為270mg/mL 。圖1不同山梨醇濃度下黑醋菌的

10、生長曲線Fig.1Gluconbacter m elanogenus gr owth curvein different s orbit ol concentrati on表130%山梨醇濃度發(fā)酵結(jié)果Table1Fer mentati on results of30%s orbit ol一次投30%山梨醇發(fā)酵10h補(bǔ)山梨醇至30%組別pH山梨糖量/(mgmL-1pH山梨糖量/(mgmL-1 20h 4.58153(3.54 4.54170(7.0724h 4.46203(10.61 4.44203(10.6128h 4.42240(7.07 4.40232(17.6730h 4.40255(7

11、.07 4.38262(10.61注:表中數(shù)據(jù)為3組數(shù)據(jù)的平均值,括號內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)偏差,下表同401微生物學(xué)雜志29卷表235%山梨醇濃度發(fā)酵結(jié)果Table 2Fer mentati on result of 35%s orbit ol一次投35%山梨醇發(fā)酵10h 補(bǔ)山梨醇至35%組別pH山梨糖量/(mg mL -1pH 山梨糖量/(mg mL -120h 4.50168(3.53 4.46175(024h 4.43195(7.07 4.38204(4.9528h 4.36232(3.53 4.35240(030h4.39240(04.36260(0表335%山梨醇濃度發(fā)酵終點(diǎn)醪液做種液對產(chǎn)糖的影

12、響Table 3The effect of fer mentati on br oth with 35%s orbit ol inoculating fer mentati on on s orbose p r oduct種液特性17%山梨醇濃度生產(chǎn)種液17%山梨醇濃度生產(chǎn)種液35%山梨醇濃度發(fā)酵醪液發(fā)酵培養(yǎng)基山梨醇量22.54%32.94%37.97%組別pH 山梨糖量發(fā)酵率/%pH 山梨糖量發(fā)酵率/%pH 山梨糖量發(fā)酵率/%/(mg mL -1/(mg mL -1/(mg mL -122h 4.57188(3.5383 4.63153(3.5346 4.58208(10.615524h 4

13、.58205(091 4.59183(3.5357 4.53240(14.16328h - 4.35250(14.176 4.43350(17.79230h - 4.43360(14.19532h-4.46270(7.0782-2.435%山梨醇濃度下不同發(fā)酵時(shí)期的醪液做種液接種時(shí)對發(fā)酵的影響選擇不同培養(yǎng)階段的35%山梨醇投料濃度發(fā)酵液作種液接種對山梨糖產(chǎn)量的影響。結(jié)果見圖2。圖2不同種液接種時(shí)的發(fā)酵結(jié)果Fig .2The fer mentati on results in different innoculium inoculating由圖2可知,作為種液,35%山梨醇投料中期發(fā)酵液作種液接

14、種發(fā)酵,效果與發(fā)酵終點(diǎn)醪液沒有明顯差別,均明顯優(yōu)于生產(chǎn)種液。3討論研究發(fā)現(xiàn),改變發(fā)酵種液特性可明顯提高山梨醇投料濃度至38%,搖瓶發(fā)酵30h 發(fā)酵率可達(dá)95%,山梨糖產(chǎn)量達(dá)360mg/mL 。而中途補(bǔ)醇,可解除底物濃度過高時(shí)對轉(zhuǎn)化酶的抑制作用;實(shí)驗(yàn)得知,菌體生長10h 達(dá)峰值,此時(shí)補(bǔ)醇可以減小高山梨醇底物濃度對菌體生長的影響。有文獻(xiàn)報(bào)道9,發(fā)酵中途流加山梨醇可提高山梨糖產(chǎn)率,但過程控制較復(fù)雜,不如一次補(bǔ)加易于操作。以35%山梨醇濃度的發(fā)酵醪液做為種液時(shí),種液培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)的外部環(huán)境一致,菌種對高山梨醇濃度已經(jīng)具備了一定的適應(yīng)力,因此,起轉(zhuǎn)化作用的酶可以迅速進(jìn)入良好的作用狀態(tài)。根據(jù)黑醋菌生長特性

15、,選擇不同培養(yǎng)階段的5014期荊士華等:生黑醋酸桿菌山梨醇高濃度發(fā)酵的培養(yǎng)特性35%山梨醇濃度發(fā)酵液, 比較接種后對產(chǎn)糖及發(fā)酵率的影響。結(jié)果表明,不同培養(yǎng)階段的發(fā)酵液間差別不大,實(shí)踐中,可選擇短期培養(yǎng)物作種液,以縮短種液制備時(shí)間,減少發(fā)酵整體周期。黑醋菌發(fā)酵時(shí)對接種量的要求很高,只有菌體達(dá)一定量時(shí)才能滿足生產(chǎn)的需要。根據(jù)黑醋菌的生長特性,發(fā)酵培養(yǎng)中期時(shí)菌體量已經(jīng)達(dá)到最大值,可以滿足發(fā)酵的要求,實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn):各時(shí)期的發(fā)酵液和發(fā)酵終點(diǎn)醪液作為種液時(shí),各組間山梨糖產(chǎn)量沒有明顯的差別。參考文獻(xiàn):1Recichsein,T,Grussner,A and Oppenauer .Synthesis

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17、05E .Shinaga wa,K .Matsushita,O.Adachi,et al .Pr oducti on of 52ket o 2D 2gluconate by acetic acid bacteria is catalyzed by pyrr ol o 2quinoline quinone (P QQ 2dependent me mbrane 2bound 2D 2glu 2conate dehydr ogenase J .Agric .B i ol .Che m.,1982,(46:1352141.6E .2S .Choi,E .2H.Lee,S .2K .Rhee .Gluc

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