電鰩乙酰膽堿受體誘導轉(zhuǎn)基因小鼠重癥肌無力的機制

1、電鰩乙酰膽堿受體誘導轉(zhuǎn)基因小鼠重癥肌無力的機制     作者：金桂花李紅花 ，孟繁平 ，李英信 ，李芳芳 ，孫昌元 金權(quán)鑫 【關鍵詞】  ,重癥肌無力;受體,膽堿能;小鼠,轉(zhuǎn)基因        摘要 目的 探討電鰩乙酰膽堿受體誘導人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠實驗性自身免疫性重癥肌無力的機制. 方法將電鰩電器官分離并純化的乙酰膽堿受體作為免疫原，免疫人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠，以放射免疫方法測定小鼠血清中抗乙酰膽堿受體抗體滴度，以免疫熒光技術觀察小鼠骨骼肌中抗乙酰膽堿受體抗體的結(jié)合性.

2、結(jié)果小鼠血清中的抗乙酰膽堿受體抗體滴度為155539pmol，小鼠肌肉中具有人抗乙酰膽堿受體抗體. 結(jié)論電鰩乙酰膽堿受體刺激人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的人抗乙酰膽堿受體抗體，可與肌肉組織中的乙酰膽堿受體結(jié)合，導致肌肉收縮無力，可誘導重癥肌無力. 關鍵詞  重癥肌無力;受體，膽堿能;小鼠，轉(zhuǎn)基因     ABSTRACT:OBJECTIVE To investigate the pathogenesis of experimental autoimmune myasthenia gravis（EAMG），induced with Torpedo acety

3、lcholine receptor（AChR），in mice transgenic for human immunoglobulin（Ig）loci.METHODS Mice transgenic for human Ig loci were immunized with Torpedo AChR，isolated and purified from electronic organs of Torpedo.The titers of anti-mouse AChR antibody in the sera of mice were determined by radioimmunoassa

4、y.The binding of human anti-AChR antibodies to the AChR in the muscle of mice was measured by immunofluorescence technique.RESULTS The titers of anti-mouse AChR antibodies in the sera ranged from155to539pmol.The human anti-AChR antibodies were found to bind to the muscle section.CONCLUSION The human

5、 anti-AChR antibodies，secreted from the mice transgenic for human Ig loci，induced with Torpedo AChR，are able to bind to AChR in the mouse muscles，which leads to the damages  of AChR，resulting in the animal EAMG.     Key words:myasthenia gravis;receptors，cholinergic;mice，transgeni

6、c     抗乙酰膽堿受體抗體與神經(jīng)肌肉接頭處的乙酰膽堿受體結(jié)合，可激活補體而使突觸后膜乙酰膽堿受體遭到破壞，導致肌肉收縮無力，出現(xiàn)重癥肌無力癥狀.引起重癥肌無力的病因目前尚不清楚，但若給動物免疫乙酰膽堿受體或注射抗乙酰膽堿受體抗體，可引發(fā)實驗性自身免疫性重癥肌無力 1，2 .在以乙酰膽堿受體作為免疫原建立重癥肌無力動物模型中，常用由電鰩電器官制備的乙酰膽堿受體，是因為電鰩的乙酰膽堿受體含量及與哺乳類動物骨骼肌乙酰膽堿受體的同源性均較高 3 .電鰩乙酰膽堿受體刺激動物產(chǎn)生的抗電鰩乙酰膽堿受體抗體可與動物本身骨骼肌的乙酰膽堿受體進行交叉反應.本實驗室曾報道了以電鰩乙

7、酰膽堿受體免疫人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠建立重癥肌無力動物模型 4，其中發(fā)現(xiàn)實驗動物出現(xiàn)重癥肌無力的關鍵癥狀，即肌肉收縮無力，血清中亦檢測到了抗電鰩乙酰膽堿受體抗體.本文探討了電鰩乙酰膽堿受體誘導人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠實驗性自身免疫性重癥肌無力的機制.     1 材料與方法     1.1 材料  含人免疫球蛋白，1，胚系基因的轉(zhuǎn)基因小鼠由荷蘭馬斯特里赫特大學醫(yī)學院神經(jīng)學系神經(jīng)免疫學實驗室根據(jù)文獻5，6介紹的方法建立.電鰩乙酰膽堿受體由本實驗室從電鰩電器官（Pacific Biomarine，California，USA）中分

8、離，并經(jīng)眼鏡蛇毒素親和層析純化獲得 7 ; 125 I-銀環(huán)蛇毒素為英國Amersham Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品;小鼠乙酰膽堿受體粗提液由本實驗室從小鼠骨骼肌中提取;羊抗人免疫球蛋白血清為本實驗室自制;羊抗人免疫球蛋白G購自美國 Cappel，ICN Pharma-ceuticals公司，用時以1100稀釋;異硫氰酸熒光素標記的兔抗羊免疫球蛋白抗體購自德國Cappel，ICN Biochemicals公司，用時以150稀釋.     1.2 動物的免疫  15g純化的電鰩乙酰膽堿受體中加入完全弗氏佐劑，注射于9只小鼠尾根部皮下，3，5

9、周后分別以15g純化的電鰩乙酰膽堿受體加入不完全弗氏佐劑行加強免疫;對照組3只小鼠只注射完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑.     1.3 抗乙酰膽堿受體抗體的測定  應用放射免疫方法測定小鼠血清中抗乙酰膽堿受體抗體的滴度. 將2nmol25 I-銀環(huán)蛇毒素混合入200L小鼠乙酰膽堿受體粗提液內(nèi)，在4條件下標記4h，加入5L動物血清，4過夜，以過量的羊抗人免疫球蛋白血清沉淀小鼠乙酰膽堿受體-抗體復合物，用磷酸鹽緩沖液洗滌后，在計數(shù)儀上測定放射比活性.抗體滴度用每升-銀環(huán)蛇毒素結(jié)合摩爾數(shù)表示.    .4 骨骼肌抗乙酰膽

10、堿受體抗體結(jié)合性測定  應用免疫熒光技術觀察小鼠骨骼肌中抗乙酰膽堿受體抗體的結(jié)合性.將小鼠骨骼肌冰凍切片并以丙酮固定后，用20g/L牛血清白蛋白封閉15min，加入羊抗人免疫球蛋白G，作用45min，洗滌，加入異硫氰酸熒光素標記的兔抗羊免疫球蛋白抗體，繼續(xù)作用45min，觀察結(jié)果.     2 結(jié)果     2.1 小鼠血清抗乙酰膽堿受體抗體滴度  在行第2次加強免疫注射電鰩乙酰膽堿受體3d后，心臟穿刺采血，檢查血清中抗體滴度.9只實驗小鼠的抗乙酰膽堿受體抗體滴度為155539pmol（Fig1）.  &

11、#160;  2.2 骨骼肌抗乙酰膽堿受體抗體的結(jié)合  免疫熒光觀察結(jié)果表明，小鼠肌肉冰凍切片中可見抗乙酰膽堿受體抗體（Fig2略）.     3 討論     自從1973年Patrick和Lindstrom  8 應用電鰻乙酰膽堿受體免疫家兔建立第一個重癥肌無力動物模型以來，已經(jīng)在小鼠、大鼠、豚鼠、猴及豬等多種動物中成功地建立了重癥肌無力模型，為研究重癥肌無力的發(fā)病機制和免疫治療提供了有效途徑.制作出與人重癥肌無力更為接近的實驗性自身免疫性重癥肌無力動物模型已成為緊迫的研究課題.較為理想的動物模型應含

12、有人免疫球蛋白、主要組織相容性抗原和乙酰膽堿受體基因.1994年Lonberg等 5     建立了表達人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，這使制作這種新的重癥肌無力動物模型成為可能.人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠無論接受何種乙酰膽堿受體的免疫刺激，均將產(chǎn)生人免疫球蛋白，得到的重癥肌無力動物模型在免疫學方面更接近人重癥肌無力.本研究結(jié)果表明，人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠在接受電鰩乙酰膽堿受體刺激后，小鼠血清中抗乙酰膽堿受體抗體滴度在 155539pmol范圍內(nèi)，僅為抗電鰩乙酰膽堿受體（免疫原）抗體滴度（6296nmol） 4 的0.2%，與Berman等 9研究結(jié)果相一致.免疫熒光觀察證

13、實，小鼠肌肉中存在人抗乙酰膽堿受體抗體.上述結(jié)果表明，電鰩乙酰膽堿受體作為免疫原，可刺激人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生人抗乙酰膽堿受體抗體，它可與肌肉組織中乙酰膽堿受體結(jié)合，導致乙酰膽堿受體功能失調(diào)，最終誘導實驗性自身免疫性重癥肌無力.人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠實驗性自身免疫性重癥肌無力動物模型的建立及其機制的闡明，為研究制作理想的重癥肌無力動物模型奠定基礎，亦為獲得人源性抗乙酰膽堿受體單克隆抗體及基因工程抗體提供了新的途徑.     參 考 文 獻     1 Meng F，Stassen M，Schillberg S，et al.Cons

14、tructionand characterization of a single chain antibody fragment derived from thymus of a patient with myasthenia gravis J.Autoimmunity，2002，35:125.     2 De Baets M，Stassen M.The role of antibodies in myas- thenia gravisJ.J Neurol Sci，2002，202:5.( )     3 Lennon VA，Lin

15、dstrom JM，Seybold ME.Experimental autoimmune myasthenia:a model of myasthenia gravis in rats and guinea pigsJ.J Exp Med，1975，141:1365. 4 李紅花，金桂花，孟繁平，等.重癥肌無力轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立J. 延邊大學醫(yī)學學報 ，2006，29（2）:79.     5 Lonberg N，Taylor LD，Harding FA，et al.Antigen-  specific human antibodies from mi

16、ce compressing four distinct genetic modificationsJ.Nature，1994，368:856.     6 Fishwild DM，O'Donnell SL，Bengoechea T，et al. High-avidity IgGmonoclonal antibodies from a novel strain of minilocus transgenic miceJ.Nat Biotechnol， 1996，14:845.     7 楊康鵑，孟繁平，de Baets M.電鰩乙酰膽堿受體的分離 和純化J