腎炎寧對LPS誘導(dǎo)人腎小球系膜細胞增殖及細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激

1、腎炎寧對LPS誘導(dǎo)人腎小球系膜細胞增殖及細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶的影響         10-09-09 14:52:00     編輯：studa20                   作者：王月華 邊東 范煥芳 郭登洲 袁國棟【摘要】  目的 探討腎炎寧對人腎小球系膜細胞(HMC)細胞

2、增殖及細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signalregulated protein kinase,ERK)的影響。方法 應(yīng)用細胞培養(yǎng)技術(shù)，進行HMC培養(yǎng)，采取血清藥理學(xué)方法，制備腎炎寧藥物血清，利用脂多糖(LPS)為刺激因子，應(yīng)用四唑鹽（MTT）比色法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測細胞的增殖和磷酸化ERK1/2的表達。結(jié)果 腎炎寧可顯著抑制HMC增殖，抑制率在12、24和48 h分別為16.0%、15.4%、18.2%，LPS組磷酸化ERK1/2的含量與空白組比較明顯升高(P<0.05)；中藥組與空白組比較，磷酸化ERK1/2含量明顯降低(P<0.05)

3、；LPS+腎炎寧組與LPS組比較，磷酸化ERK1/2表達明顯降低 (P<0.05)。結(jié)論 腎炎寧具有抑制正常培養(yǎng)條件及LPS刺激條件下磷酸化ERK1/2，從而發(fā)揮對腎小球硬化的治療作用。 【關(guān)鍵詞】  腎炎寧；系膜細胞培養(yǎng)；增殖；細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶    【Abstract】Objective  To investigate the effect of Shenyanning on the expression of extracellular signalregulated protein kinase of human mesan

4、gial cells(HMCs).Methods  HMCs were cultured by applying cell cultural technique.The serum pharmacological method was used in the preparation of shenyanning serum.HMC proliferation was detected by MTT.The pERK1/2 expression was detected by enzymelinked immunosorbentassay (ELISA) taking lipopoly

5、saccharide (LPS) as stimulating factor.Results  Shenyanning significantly inhibited HMC proliferation；and the inhibition ratios of medium dose were 16.0%，15.4% and 18.2%   when HMC were cultured for 12，24 and 48 h.The content of pERK1/2 in LPS group was obviously higher than that in b

6、lank group(P<0.01)，that in shenyanning group was obviously lower than that in blank group(P<0.05).The expression of pERK1/2 in LPS combined Shenyanning group was obviously lower than that in LPS group(P<0.01).Conclusions  Shenyanning could inhibit the expression of pERK1/2 in the condi

7、tion of normal or LPS stimulation，which may be the mechanism of Shenyanning in the delay of glomerularsclerosis.    【Key words】  Shenyanning；Mesangial cell culture；Proiferation；Extracellular signalregulated protein kinase    IgA腎病是目前最常見的原發(fā)性腎小球腎炎之一,15%20%的患者在確診后10年內(nèi)

8、、30%35%的患者在確診后20年內(nèi)進入終末期腎衰竭(ESRF)1。本病特征為彌漫性腎小球系膜區(qū)免疫球蛋白沉積，并有腎小球系膜細胞(MC)增殖。MC分泌細胞因子及細胞外基質(zhì)（ECM），參與腎小球炎癥發(fā)展過程，促進腎小球硬化。抑制炎癥狀態(tài)下MC的增殖與分泌，在IgA腎病的治療中有重要意義2。我們根據(jù)中醫(yī)理論，探究本病病因病機，提出“益氣養(yǎng)陰化瘀祛濕法”，并依法組方腎炎寧治療IgA腎病，臨床取得了較好的療效3，4。鑒于此，本研究試圖通過觀察腎炎寧對人MC（HMC）細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signalregulated protein kinase,ERK)的影響，以探討

9、其臨床藥效及部分作用機制。1  材料與方法1.1  材料 LPS(美國Sigma公司);型膠原酶、RPIM1640(均為Sigma公司產(chǎn)品)；ELISA試劑盒由美國Santa Cruz公司提供；腎炎寧(由黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)、女貞子、旱蓮草、生地黃、白茅根、川芎、白花蛇舌草、三七粉、仙鶴草等組成)，由本院制劑室提供。1.2 藥物血清制備 選年齡、體重相近的成年健康志愿者2名。其中1名口服腎炎寧，每日2次；連續(xù)3 d。末次用藥1 h后無菌取靜脈血20 ml，分離血清，56 30 min滅活處理后用0.22 m微孔濾膜過濾，70冰箱保存?zhèn)溆?。不服用藥物?

10、名同時采血，分離血清備用。1.3  系膜細胞的培養(yǎng)及鑒定 HMC取自5月大的引產(chǎn)胎腎，由河北醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院提供，迅速無菌取其腎臟，剝除腎包膜，將腎皮質(zhì)剪成碎屑，研磨依次通過80、140、220目篩網(wǎng)，收集腎小球，型膠原酶消化7 min，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液為含20% FCs、HEPES、青霉素、鏈霉素的RPMI1640液。5 d左右，腎小球貼壁，周圍長出細胞，首次換液，以后每2天換液1次。當(dāng)HMC長至80%融合時，用胰蛋白酶消化傳代。亞培養(yǎng)的系膜細胞生長很快，23 d布滿瓶底，可凍存?zhèn)溆?，?jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為MCs，取45代細胞為實驗所用。1.4  采用四

11、唑鹽(MTT)比色法檢測細胞增殖 MCs以1×104/孔接種于96孔板內(nèi)，24 h后換成含1%胎牛血清的培養(yǎng)液孵育24 h，使細胞同步于靜止期，棄上清；96孔板從左至右依次分為空白對照組(簡稱空白組，加入5%正常人血清)、腎炎寧組(加入5%腎炎寧藥物血清)、脂多糖(LPS)組(加入LPS10 g/L和5%正常血清)、LPS+腎炎寧組(加入LPS 10 g/L和5%腎炎寧藥物血清)共4個組，每組設(shè)有6個復(fù)孔。各組均加入含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,使血清終濃度為10%，每孔培養(yǎng)液總量為200 l，37、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。分別于培養(yǎng)12、24和48 h時取出培養(yǎng)液

12、，加入MTT 20 l(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄各孔培養(yǎng)液，加入100 l DMSO，室溫避光，輕輕震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀490 nm波長處讀取OD值。1.5  ELISA方法測定磷酸化ERK1/2的表達 HMC經(jīng)上述方法同步化后，37、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h，準(zhǔn)備指標(biāo)檢測。     10-09-09 14:52:00     編輯：studa201.6  統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以x±s表示，組

13、間兩兩比較采用t檢驗法。2  結(jié)果    腎炎寧可顯著抑制HMC增殖，抑制率在12、24和48 h分別為16.0%、15.4%、18.2%，LPS組磷酸化ERK1/2的含量與空白組比較明顯升高(P<0.05)；中藥組與空白組比較，磷酸化ERK1/2含量明顯降低(P<0.05)；LPS+腎炎寧組與LPS組比較，磷酸化ERK1/2表達明顯降低 (P<0.05)。見表1。表1  各組HMC細胞增殖及磷酸化ERK1/2的表達(略)3  討論    IgA腎病發(fā)病率逐年遞增，隨著對IgA腎病研究的

14、日益深入，已知其預(yù)后并不樂觀。本病在中醫(yī)內(nèi)科中主要歸屬于“尿血”、“腰痛”、“水腫”范疇，多數(shù)患者起病隱匿。其發(fā)病與多種因素有關(guān)。但其基本病機是本虛標(biāo)實。金匱要略注云：“五臟六腑之血，全賴脾氣統(tǒng)攝”。脾有統(tǒng)攝血流在經(jīng)脈中流行、防止溢出脈外的功能。脾的功能正常則血不會溢出脈外。反之，脾氣虧虛、統(tǒng)血不力，即可導(dǎo)致尿血。腎氣虛憊，失于封藏，也致尿血日久不愈，蛋白等精微物質(zhì)從尿中流失。腎陰虧虛，陰虛火旺，灼傷脈絡(luò)亦可見精微物質(zhì)從尿中流失。脾虛不能運化水濕，腎虛不能化氣行水，精微外泄而水液停滯，則見尿濁浮腫；病情繼續(xù)發(fā)展，氣血俱傷，脾腎失養(yǎng)，濁毒內(nèi)停，三焦受阻，升降失常，水濕泛濫?！爸撂撝帲闶橇粜爸?/p>

15、地”，病程日久，腎之絡(luò)脈氣陰兩虛，氣虛無力運血而致血瘀；陰虛火旺，煎熬津液，津虧液少則血液黏稠不暢而致陰虛血瘀，腎絡(luò)瘀阻，致使腎體受損，腎用失司，導(dǎo)致本病的發(fā)生?？傊琁gA腎病形成機制是非常復(fù)雜的。既有脾腎臟腑功能失調(diào)，致氣陰兩虛，又有濕濁瘀血作祟。鑒于此我們提出“益氣養(yǎng)陰化瘀祛濕法”治療本病，并依法組方腎炎寧，臨床取得了較好的療效3，4。方中黃芪益氣固表，利水消腫，且黃芪大補宗氣，使氣旺血行。黨參、茯苓、白術(shù)補中、健脾、益氣，祛濕；白茅根、生地黃、女貞子、旱蓮草養(yǎng)陰補腎、涼血止血；川芎活血行氣；三七粉、仙鶴草活血止血。該方標(biāo)本兼顧，虛實并重，確能切中病機。   

16、; MC屬于腎小球毛細血管網(wǎng)周細胞，正常時不發(fā)生明顯的增殖，但在炎癥，免疫復(fù)合物等病理情況下則出現(xiàn)異常的增生5。MC的過度增殖，一方面突入腎小球毛細血管腔，導(dǎo)致管腔狹窄或閉塞；另一方面分泌大量ECM并且積聚在腎小球內(nèi)，導(dǎo)致腎小球硬化，造成腎臟功能進行性損害6，7。因此，有效地抑制MC的增殖將會在很大程度上減緩腎小球硬化及慢性腎炎的進展。絲裂素活化蛋白激酶（mitogenactived protein kinase,MAPK）級聯(lián)是真核介導(dǎo)細胞外信號到細胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)著機體細胞的生長、分化、分裂、死亡以及細胞間的功能同步等多種功能8。哺乳動中，MAPK包括5個亞類：即ERK、J

17、NK、p38、ERK3/4、ERK5。ERK包括兩個高度同源的亞類ERK1和2。胞外刺激可經(jīng)G蛋白受體、生長因子受體和酪氨酸蛋白激酶受體，經(jīng)RafMEKERK級聯(lián)信號激活ERK,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子和一些激酶活性，促進細胞增殖，蛋白質(zhì)合成9，10。因此，本研究選取磷酸化ERK1/2觀察腎炎寧對系膜細胞增殖的影響。結(jié)果顯示，腎炎寧可顯著抑制HMC的增殖，抑制正常培養(yǎng)條件及LPS刺激條件下磷酸化ERK1/2，從而發(fā)揮對腎小球硬化的治療作用?！緟⒖嘉墨I】  1 Donadio JV,Grande JP.IgA nephropathyJ.N Engl J Med,2002；34:73848.2 Li

18、u Y.Epithelial tomesenchymal transition in renal fibrogenesis：pathologic significance，molecular mechanism，and therapeutic interventionJ.J Am Soc Nephrol，2004；15(1)：112.3 郭登洲,謝惠芬,王彥剛，等.腎炎寧治療小兒IgA腎病25例療效觀察J.新中醫(yī)，2003；35（4）：167.4 郭登洲,謝惠芬,王彥剛，等.腎炎寧治療IgA腎病的臨床研究J.中華實用中西醫(yī)雜志，2003；3(16):2156.5 Schwarz M，Wahl

19、M，Resch K,et al.IFN gamma induces functional chemokine receptor expression in human mesangial cellsJ.Clin Exp Immunol，2002;128(2)：28594.6 DiezMarques L，OrtegaVelazquez R，Langa C,et al.Expression of endoglin in human mesangial cells：modulation of extracellular matrix synthesisJ.Biochim Biophys Acta，2002；1587(1)：3644.7 Lee S，Lee S，Sharma K.The pathogenesis of fibrosis and renal disea