猴免疫缺陷病毒外膜糖蛋白基因序列重組和突變克隆的轉(zhuǎn)染研究

1、    猴免疫缺陷病毒外膜糖蛋白基因序列重組 和突變克隆的轉(zhuǎn)染研究        【 摘要 】目的研究猴免疫缺陷病毒(SIV)外膜糖蛋白(envGP)基因片段與病毒復(fù)制功能的關(guān)系。 方法利用兩病毒株共有的內(nèi)切酶位點(diǎn)，將非致病性SIVmac 142株envGP區(qū)的DNA片段與致病性SIVmac 239株的對應(yīng)區(qū)域進(jìn)行置換，構(gòu)成多個(gè)重組體。RFLP和部分序列測序確定后，用等量突變病毒(3g)轉(zhuǎn)染CD4+T淋巴細(xì)胞CEM×174細(xì)胞系，用ELISA監(jiān)測培養(yǎng)液中S

2、IV核心蛋白P27水平的變化，以判定重組病毒的復(fù)制能力。 結(jié)果與SIVmac 239株相比，SIVmac 239 envGP重組體(SIVmac142/239 envGP/142)仍保持高度的復(fù)制活性，SIVmac239gp41(SIVmac142/239gp41/142)或SIVmac239N-gp41(SIVmac142/239N-gp41/142)的復(fù)制能力明顯降低，而SIVmac239C-gp41(SIVmac142/239C-gp41/142)重組體無復(fù)制活性。 結(jié)論envGP基因是SIVmac239株復(fù)制能力或毒力的重要調(diào)節(jié)因素?！?主題詞 】猴免疫缺陷病毒； 外膜糖蛋白； 重組；

3、 轉(zhuǎn)染； 病毒復(fù)制 Sequential recombination of SIV envelope protein (ENV) gene and study on transfection by the mutant clonesLIU Xiaomin, XU Ying, PAN Shangha（Laboratory of Molecular Biology, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, P.R.China）【 Abstract 】ObjectiveTo study th

4、e relationship between DNA fragments in ENV gene of SIVmac and viral replicating ability. Methods Reciprocal recombinants were constructed by replacing the clonable DNA fragments of ENV region of the nonpathogenic SIVmac142 clone with the pathogenic SIVmac 239 clone. Following confirmation by RFLP a

5、nd partial sequence analysis, the aliquot mutant viruses (3g) were used to transfect CEM×174 cell line, and the concentration of SIVmac main core protein(P27) in culture supernatants was closely monitored by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in order to identify the replicating ability

6、of the mutants. ResultsCompared with SIVmac 239 clone, SIVmac 239 envGP recombinant (SIVmac142/239envGP/142) was still imbued with high replicating activity; and SIVmac239gp41 (SIVmac142/239gp41/142) or SIVmac239N-gp41 (SIVmac142/239N-gp41/142) with comparably decreasing activity, while SIVmac239C-g

7、p41(SIVmac142/239C-gp41/142) lacked replicating activity. ConclusionENV is an important regulating element to the replication or virulence of SIVmac239 clone.【 Subject words 】SIV; ENV; Recombination; Transfection; Viral replication猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency viruses SIV)是一組在致病性和毒力方面具有多樣性的靈長類動物病毒

8、，其中，SIVmac239克隆感染的猴表現(xiàn)為與人類AIDS相似的疾病，稱之為致?。ɑ蛴卸荆┲?，而SIVmac142克隆僅引起猴發(fā)生病毒血癥，不發(fā)生臨床綜合征，稱之為非致病（或無毒）株1。一般認(rèn)為，外膜糖蛋白(envGP)在病毒的感染和免疫中起重要作用，而SIVmac239和SIVmac142克隆之間envGP區(qū)核苷酸的差別，是否提示SIVmac239克隆的致病性或毒力與envGP全區(qū)、部分或個(gè)別核苷酸有關(guān)，仍需要進(jìn)一步研究2，3。本研究根據(jù)SIV基因組的內(nèi)切酶譜，用致病性SIVmac239克隆的相應(yīng)片段與非致病性SIVmac142克隆的envGP全區(qū)、gp41、N-gp41或C-gp41區(qū)進(jìn)行

9、置換，并采用SIV基因組中Gag基因的產(chǎn)物SIV主要核心蛋白P27為指標(biāo)，對重組病毒轉(zhuǎn)染CD4+T淋巴細(xì)胞CEM×174細(xì)胞后的復(fù)制能力進(jìn)行測定和比較。材料和方法主要試劑：限制性內(nèi)切酶和T4連接酶(New England Bio-Lab)，感受態(tài)細(xì)胞和CEM×174細(xì)胞(Stratagene)，DNA序列分析試劑盒(USB)，35S -dATP(Amershan)，DNA純化試劑盒(Bio101)，質(zhì)粒PBS-SIVmac239半病毒克隆(P239-5，P239-3)和PBS-SIVmac142半病毒克隆(P142-5，P142-3)由New England提供，SIV核心

10、抗原P27酶聯(lián)免疫分析試劑盒由美國馬里蘭大學(xué)免疫微生物系贈送。1P239-3和P142-3克隆間重組體構(gòu)建示意Fig 1. Schematic construction of recombinants between P239-3 and P142-3 clone*: Unique Nhe site in LTR of P142-3 cloneRegional Primate Research Center半病毒重組體的構(gòu)建：分別對P239-3和P142-3半病毒克隆進(jìn)行完全或部分酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離并收集envGP區(qū)相應(yīng)的片段，Na-glassmilk法純化，將P239-3中的envGP

11、區(qū)全段，gp41區(qū)，N-gp41區(qū)或C-gp41區(qū)分別與P142-3 envGP區(qū)的相應(yīng)片段互換，轉(zhuǎn)化后，利用IPTG、X-gal和抗菌素雙重篩選重組的半病毒克隆。酶切和測序鑒定：利用Nhe等內(nèi)切酶，對重組體進(jìn)行RFLP分析。采用雙脫氧末端終止法測定克隆點(diǎn)交界區(qū)DNA序列，證實(shí)重組片段的正確性。重組病毒的構(gòu)建：將經(jīng)測序確定的重組體分別與SIVmac142-5半病毒克隆(P142-5)經(jīng)Sph切點(diǎn)連接，形成完整的病毒重組體。轉(zhuǎn)染試驗(yàn)：采用DEAE-dextran轉(zhuǎn)染方法，用等量的重組病毒DNA(3g)分別轉(zhuǎn)染CEM×174細(xì)胞，其過程按文獻(xiàn)4方法進(jìn)行。酶聯(lián)免疫分析：每隔3d連續(xù)多次收集

12、轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)，ELISA法測定SIV核心抗原P27的濃度，方法步驟大致同文獻(xiàn)5。結(jié)果1.SIVmac239-142重組體的構(gòu)建：根據(jù)SIVmac142和239株基因組的核苷酸序列譜，在兩病毒envGP區(qū)的特定部位含有相同的內(nèi)切酶位點(diǎn)，可以進(jìn)行DNA片段的互換和克隆，在完全或不完全酶切后，電泳分離、收集、純化所需的片段，用P239-3的envGP(Sph-Sac，64509230，2.78kb)、gp41(Ban-Sac，81709230，1.06kb)、N-gp41(Ban-Nhe，81708750，0.58kb)或C-gp41(Nhe-Sac，87509230，0.48kb)分別替換P

13、142-3的相對應(yīng)片段，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、形成重組的半病毒克隆（1）。重組的半病毒克隆經(jīng)Sph切點(diǎn)與SIVmac142-5相連形成4種完整的病毒重組體。包括：SIVmac239envGP(SIVmac142/239envGP/142)，SIVmac239gp41(SIVmac142/239gp41/142)，SIVmac239N-gp41(SIVmac142/239N-gp41/142)和SIVmac239C-gp41(SIVmac142/239C-gp41/142)。2.酶切、測序鑒定重組體：根據(jù)P142-3區(qū)長末端重復(fù)區(qū)(LTR)獨(dú)具另一Nhe切點(diǎn)(9309)的特性，對重組的半病毒克隆進(jìn)行Sp

14、h+Nhe酶切分析，電泳顯示一約1.1kb的特異片段(82379309)，證實(shí)重組體3端下游LTR區(qū)為SIVmac142序列（2）。根據(jù)克隆點(diǎn)上、下游核苷序列設(shè)計(jì)引物如下：P1：5-ATCACTCCAATTGGCTTGGC-3(8109-8128)P2：5-GAATAGCTGGGATGTGTT-3(8621-8638)P3：5-GACAAGGGCTTGAGCTCACT-3(9217-9236)采用雙脫氧末端終止法測定重組體內(nèi)239-142交界區(qū)的DNA序列，證實(shí)重組序列的正確性。3.轉(zhuǎn)染后SIVmac核心抗原(P27)的動態(tài)分析：用ELISA方法測定重組病毒轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)液中SIVmac主要核心蛋

15、白P27的濃度及其動態(tài)演變，以推測病毒復(fù)制能力的變化。結(jié)果顯示：與SIVmac239株相比，SIVmac239envGP的復(fù)制能力無明顯差異，而克隆轉(zhuǎn)染后P27水平明顯下降，但于轉(zhuǎn)染后1821d時(shí)仍可達(dá)到試劑盒方法所界定的陽性復(fù)制水平(0.40ng/ml，見表1)5。SIVmac239C-gp41克隆與SIVmac142克隆一樣，在轉(zhuǎn)染后CEM×174細(xì)胞系中不具有復(fù)制活性（表1）。 2Sph、Nhe分析SIV半病毒重組體(P239envGP)Fig 2. Identification of SIV half virus recombinant(P239envGP) by Sph+N

16、heLane 1,2,3,4,5: P239envGP after Sph+Nhe digestion; Lane 6: -Hind DNA marker; Lane 7,8,9,10,11: P239envGP after Sphcomplete and Nhepartial digestionA: 1.1kb special fragment of Nhe-Nhe(82378309)B: 4.8kb fragement for P239C-gp41 cloning(reference Fig. 1)SIVmac239gp41或N-gp41 討論SIV與人類免疫缺陷病毒(HIV)是在進(jìn)化上高

17、度同源、在致病性上非常相似的靈長類病毒。對SIV的研究是人類探索AIDS病因、發(fā)病機(jī)制、治療和預(yù)防的重要模型。SIV的envGP基因(gp160)主要由gp120和gp41兩個(gè)區(qū)域構(gòu)成，gp41拷貝轉(zhuǎn)膜蛋白(TMP)，其分子結(jié)構(gòu)的改變與SIVmac在人類細(xì)胞中的復(fù)制力不同有關(guān)6。在SIVmac239和SIVmac142兩克隆之間，envGP區(qū)域核苷酸組成的差異和分布與envGP的功能或與病毒致病性的關(guān)系目前尚不清楚。P27是由SIV基因組中Gag基因拷貝的SIV主要核心蛋白(main core protein)。一般認(rèn)為，Gag基因及其產(chǎn)物與envGP 、Pol和LTR等共同參與調(diào)節(jié)病毒的感染

18、和復(fù)制過程。研究表明，SIV感染的猴從急性期存活的現(xiàn)象看與病毒復(fù)制的降調(diào)節(jié)有關(guān)，同時(shí)伴有針對SIV envGP和Gag蛋白抗體的產(chǎn)生7。用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定病毒原液、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中Gag蛋白P27(core protein P27)的濃度，具有使標(biāo)本微型化，更簡單經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。且測定液中P27濃度與游離病毒的含量具有良好的一致性，它優(yōu)于其它更間接測定SIV復(fù)制水平的方法，是一種敏感的量化指標(biāo)5,7,8。本研究利用兩種病毒克隆envGP區(qū)DNA片段的可互換性，成功地建立了SIVmac142239之間的多項(xiàng)重組體并進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染后，全envGP區(qū)重組體(SIVmac239

19、envGP)具有較強(qiáng)的復(fù)制活性；SIVmac239gp41克隆或SIVmac239N-gp41克隆的復(fù)制能力明顯低于前者；而SIVmac239C-gp41克隆不具有復(fù)制能力。與國外同類研究相似，本研究結(jié)果提示，SIVmac239envGP基因區(qū)的組成和完整性與SIV的復(fù)制能力（或毒力）有關(guān)8-10。此外，多項(xiàng)重組體轉(zhuǎn)染結(jié)果提示，envGP基因中N-gp41和gp120區(qū)域的核苷酸結(jié)構(gòu)對維系envGP的功能更顯重要。SIVmac239C-gp41克隆在轉(zhuǎn)染后不具備復(fù)制活性，尚不能被清楚解釋，是否間接提示N端gp41區(qū)的某些或個(gè)別核苷酸與病毒的復(fù)制力或毒力有關(guān)，需要PCR誘導(dǎo)突變等進(jìn)一步研究。表1

20、免疫熒光法測定轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)液中SIV核心蛋白P27的濃度Table 1. Measurement of SIV core protein P27 in transfected culture medium by ELISASIV or recombinantSIV core protein P27Identificationof result#day3day6day9day12day15day18day21day24day27SIVmac2390.040.442.452.101.310.531.871.801.60(+)(150)*(1100)(1100)(1100)(1100)(1100)(1

21、100)SIVmac1420.040.040.030.020.020.050.010.090.07(-)SIVmac239envGP0.040.031.361.751.711.301.250.21(+)(1100)(1100)(1100)(1100)(1100)SIVmac239gp410.020.020.010.010.020.472.480.410.31(+)SIVmac239N-gp410.050.050.060.090.180.801.20(+)SIVmac239C-gp410.040.040.030.040.030.020.030.100.04(-) Wavelength 450-5

22、70nm, blank subtracted* Ratio of dilution with RPMI 1640# The point for positive level is above 0.40ng/ml 基金項(xiàng)目：國家教委留學(xué)歸國人員基金資助項(xiàng)目劉曉民（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院分子生物室）徐瑩（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院分子生物室）潘尚哈（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院分子生物室）畢麗（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院分子生物室）李言（美國馬里蘭大學(xué)免疫微生物系）參考文獻(xiàn)1，Hirsch VM, Johnson PR. Pathogenic diversity of simian immunodeficien

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