誘導型一氧化氮合酶與疾病

1、誘導型一氧化氮合酶與疾病關(guān)鍵詞：一氧化氮；疾病中國病理生理雜志000226 中分類號 R318.04 文獻標識碼A文章編號 1000-4718(2000)02-0179-05Inducible nitric oxide synthase in diseasesCHEN Shen-ren, CHEN Lin-xin(The 2nd Clinical School in Medical College of Shantou University,Shantou 515041)CHEN Shao-ru(Pathophysiology of Medical College, Shantou Unive

2、rsity, Shantou 515031, China)【A Review】 Nitric oxide(NO) is a biologically active molecule in vivo，it has been found to play an important role not only as a cytotoxic effector but also an immune regulatory mediator and a signal molecule of message transmission.The inducible NO synthase (iNOS) produc

3、es NO after cells were activated and play a rather complicated pathophysiological action in a variety of human diseases or disorders. The molecular biological character of iNOS，its expression in human diseases and probable significance were reviewed.MeSH Nitric Oxide; Disease遲至20世紀80年代末，一氧化氮(nitric

4、oxide， NO)才被認識到是人體內(nèi)一種生物學活性分子。人體內(nèi)的NO有兩個來源。一為非酶生(non-enzymstigenese)，來自體表或者攝入的無機氮的化學降解/轉(zhuǎn)化；一為酶生(enzymstigenese)，由NO合酶(NO synthase NOS)所合成。現(xiàn)已認識到NO既是一個有細胞毒性效應(yīng)器作用的分子，是組織損傷的誘發(fā)因子和各種病變的增強因子，有其病理上不好的一面；又是生物體許多部分的信號(signal)分子，是先天性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)性效應(yīng)分子，作為一種信息傳遞物質(zhì)維持正常的生理功能，有其生理性好的一面。NO的這種雙重性在人體的生理和病理過程中起了非常重要的作用1。人體內(nèi)的NOS

5、目前發(fā)現(xiàn)并定名有3類。基因定位于第12對常染色體的I型NOS主要存在腦和神經(jīng)細胞的細胞質(zhì)內(nèi)，稱為腦型(bNOS)或神經(jīng)型(nNOS)2；定位于常染色體7上的III型NOS主要存在于血管內(nèi)皮細胞的細胞膜上，稱為內(nèi)皮型(eNOS)3；I型和III型又統(tǒng)稱構(gòu)成型(constitutive NOS，cNOS)，是許多正常組織中基本存在的一種酶，其合成的NO在維持神經(jīng)細胞的效應(yīng)傳遞功能和血管的舒縮功能，保證血管擴張、血液供應(yīng)上很重要。cNOS合成的NO壽命極短(幾秒到幾分鐘)。定位于第17對常染色體上的II型NOS稱為誘導型(iducible NOS，iNOS)，只在細胞受到刺激被激活后才表達4。生產(chǎn)N

6、O能持續(xù)相對較長時間(幾h到幾d)。短暫合成和持續(xù)產(chǎn)生的這兩種NO在病理生理學上的意義完全不同5。iNOS以存在于白細胞等炎癥細胞的細胞質(zhì)中為代表(也發(fā)現(xiàn)于腦、胰、視網(wǎng)膜、肝、肺、心臟或腎臟等許多器官組織)，與炎癥、腫瘤、退行性變等許多疾病有關(guān)。誘導iNOS的刺激物包括血紅素、細胞因子、需氧應(yīng)激、IFN-、 TNF-、 IL-1等。本文綜述限于 iNOS和各類疾病關(guān)系上的認識和理解。一、人iNOS的生物學特征iNOS基因位于第17對常染色體的17cen-ql1.2位上，長約37kb4。其轉(zhuǎn)錄受細胞因子、脂多糖(LPS)和其他炎癥介質(zhì)控制5。但由于這一轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相當復雜且有組織特異性，要定性其基因

7、表達的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后所有轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)因子尚有一定困難。iNOS的開放閱讀片(open reading frame)由27個外顯子所編碼，包括翻譯始動位(于外顯子2)和終止位(于外顯子27)6。人iNOS基因的所有內(nèi)含子/外顯子的界限嚴格遵守已知的 GT/AG，供體/受體規(guī)則。盡管其編碼區(qū)(尤其輔因子結(jié)合位點)的結(jié)構(gòu)與 nNOS和 eNOS非常相似，但iNOS基因在外顯子2226上有多個帶，不如 cNOS只在染色體上有1個帶。現(xiàn)己通過熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization , FISH)分析發(fā)現(xiàn)iNOS有3個小的等位基因變異，其中1個在抵抗疾病感染上有

8、病理生理學意義7。不同組織克隆得到的iNOS cDNA只在其編譯的氨基酸序列上有小的差異，而不同種屬和不同細胞類型iNOS的異構(gòu)體具高度同源性(支持為同一基因產(chǎn)物)。和鼠的 iNOS比較，人 iNOS啟動子由于在LPS /IFN-應(yīng)答增強子區(qū)段核苷酸的變化(-1083-1229)，對 LPS/IFN-反應(yīng)性低8。由 IL-1、TNF-和INF-所調(diào)理誘導的轉(zhuǎn)錄因子 NF-B和 iNOS啟動子的結(jié)合比較松散9。不過，有3個與調(diào)節(jié)成分(位于啟動子區(qū)段中-3.8-16kb之間)同側(cè)的細胞因子反應(yīng)區(qū)足以被細胞因子所誘導10。有趣的是，人iNOS基因含有1個與 eNOS相同的需氧應(yīng)激成分(GAGACC)

9、，在缺氧情況下，這個應(yīng)激成分誘導NO產(chǎn)生似是防止心血管疾患的關(guān)鍵(通過NO對白細胞粘附、血小板聚集和血管平滑肌細胞增殖的抑制)11。已發(fā)現(xiàn)鼠的iNOS啟動子-226-212處有1個含有與人的缺氧應(yīng)答成分(hypoxia-reponsive element，HRE)12同源序列足以在 IFN-活化的巨噬細胞內(nèi)氧分壓下降時通過與缺氧所誘生的缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-l)結(jié)合，誘導iNOS合成NO。盡管人HRE的活性因其同義序列上有兩處失諧尚存爭議，但培養(yǎng)中的人肝腫瘤細胞在缺氧狀態(tài)下的確誘導了iNOS合成NO13?？傊说膇NOS啟動子是迄今己知的

10、最大、最復雜的1個，嚴格控制iNOS基因的表達。人iNOS的 TATA盒位于轉(zhuǎn)錄始動部位上游30bp處，巨噬細胞和上皮細胞內(nèi)的iNOS轉(zhuǎn)錄有6%左右在多個起始部位發(fā)動，部分甚至從 TATA指導的主起始部位伸延開幾百個鹼基對的上游區(qū)14。這樣，通過替代拼接(alternative splicing)獲得的 iNOS mRNA更多樣化且穩(wěn)定性不同。人iNOS mRNA上有一個含8個部分重疊的開放閱讀片的長且復雜的5非翻譯區(qū)(5UTR)，顯示了其在翻譯水平上的不穩(wěn)定性和組織特異性15；而iNOS基因的3端多聚(腺苷酸)(poly)區(qū)域下游10bp處有1個富含 GT的多聚(腺苷酸)信號區(qū)(polysi

11、gnal)不同于通常的 poly(AATAAA)16，也可能造成基因表達及 mRNA穩(wěn)定性的差異。二、各種疾病中iNOS的表達和意義(一)感染性疾病 NO在人和外環(huán)境的界面上起了關(guān)鍵的保護作用。舌表面任何厭氧菌可將唾液中的硝酸鹽降解為亞硝酸鹽，吞咽到胃的酸性環(huán)境形成NO；人皮膚表面也不斷釋放NO，這是皮膚共生菌將汗液中硝酸鹽降解為亞硝酸鹽在酸性環(huán)境下所形成。長期用抗生素的病人會減少這類 NO的產(chǎn)生。另外，健康人鼻旁竇中NO濃度接近大氣污染允許的最上限。這均顯示NO在人類抵抗病原體侵入中起了重要作用1。在人體內(nèi)，被活化的巨噬細胞通過NO殺滅鳥胞內(nèi)分支桿菌、克魯斯錐蟲、大型(熱帶)利什曼原蟲1；N

12、O還激活星形膠質(zhì)細胞抑制新型隱球菌生長17；人體血液中的中性粒細胞被細胞因子激活后通過 iNOS合成NO使進入體內(nèi)的金黃色葡萄球菌和埃舍利希大腸桿菌的酪氨酸硝基化18。這均證實 iNOS在各種感染性疾病中的表達。感染并發(fā)休克和器官衰竭者死亡率很高。NO是一種內(nèi)源性血管擴張劑，至今的大多數(shù)動物及人體研究提示iNOS合成的NO在膿毒性休克中起了誘發(fā)和致病作用，NO產(chǎn)生過多引起膿毒性休克的低血壓和血流異常并進一步參與器官功能障礙的發(fā)生、發(fā)展和擴大。高濃度的NO在體外破壞細胞代謝，損傷DNA引起細胞死亡，直接損傷組織，而且促進吞噬細胞分泌TNF，繼而增加細胞因子介導的組織損害，因此，NO也可能參與膿毒

13、血癥引起的心肌抑制。因此似乎可得出這樣的結(jié)論：(1)膿毒性休克所致低血壓與NO過量產(chǎn)生有關(guān)；(2)NO過量產(chǎn)生使死亡率上升；(3)NOS抑制劑是安全有益的19。在膿毒性休克病人應(yīng)用低劑量特異性NOS抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)血管張力下降和血壓掉落，但也使心排出量下降20。由于NO有擴張血管、阻斷血小板和白細胞粘附內(nèi)皮細胞、清除超氧化物的功能，膿毒性休克時增加NO量可維持小血管內(nèi)血流，保護內(nèi)皮細胞不受氧化應(yīng)激的損害。而iNOS產(chǎn)生的NO可抵消膿毒血癥引起的血管收縮作用，并通過細胞毒性作用對細胞內(nèi)病原體發(fā)揮毒殺作用。另一方面，NO有調(diào)節(jié)細胞因子產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)作用，可能對宿主的防御功能有益。因此，過分用NOS

14、抑制劑抑制NO的釋放可能有害19。在正常人對抗入侵微生物中，在不同感染性疾病中，cNOS和iNOS所合成NO意義的不同；不同器官組織iNOS表達的差異及NO在休克早期和晚期作用的可能差別尚須進一步去闡明。(二)自身免疫性與慢性炎癥性疾病 NO氧化產(chǎn)物亞硝酸鹽在類風濕關(guān)節(jié)炎病人滑液中比骨關(guān)節(jié)炎高635倍，多發(fā)性硬化病人脫髓鞘部位巨噬細胞的iNOS和硝基酪氨酸染色陽性，這些細胞在培養(yǎng)中也產(chǎn)生大量NO1。胰島素依賴型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellilus ,IDDM)型糖尿病90%以上胰島被破壞，在 IDDM大鼠動物模型浸潤于胰島的巨噬細胞中檢出iNOSl，且

15、 大鼠胰島細胞尤容易發(fā)生NO誘導的細胞死亡21。作為IDDM動物模型的佐劑，同樣對人有致IDDM作用的鏈脲霉素(streptozocin)對胰島的特異毒性作用至少部分由細胞內(nèi)釋放的NO所致1。這些均說明iNOS在自身免疫性疾病中的表達及其合成的NO對組織的破壞。然而，還必須明確是否對其抑制可減輕對此類疾病的組織破壞。系統(tǒng)性紅斑狼皰(systemic lupus erythematosus, SLE)病人血清NO水平明顯高于正常對照者，而活動期SLE病人血清NO水平又明顯高于非活動期SLE，SLE病人血清NO水平與病情活動度呈正相關(guān)，和SLE病人dsDNA抗體水平也呈正相關(guān)22。研究表明SLE病

16、人NO的產(chǎn)生增加主要是通過iNOS的升調(diào)節(jié)(up-regulation)在被激活的血管內(nèi)皮細胞和表皮角化細胞中的表達增高22。iNOS的免疫反應(yīng)性表達在氣道、血管、腸、腎、心臟、皮膚和牙周根尖等各種慢性炎癥性疾病中有些局限于巨噬細胞，但大部分在炎癥區(qū)周圍的上皮細胞。這些細胞iNOS的作用未明，新近資料表明，受累組織局部由iNOS合成的NO不只簡單地引起組織破壞，也影響Th1/Th2的平衡。尤其非細胞毒濃度的NO對Th1型細胞因子如IL_2和INF_起降調(diào)節(jié)(down-regulation)作用，并且/或者增加Th2相關(guān)分子IL_4和PGE2的產(chǎn)量及IL_4p40基因的表達23。因此iNOS合成

17、的NO也局限Th1免疫應(yīng)答及其所致的組織破壞。另外，由于Thl型細胞因子和iNOS表達的密切相關(guān)，iNOS的表達似可作為Thl反應(yīng)的一個標記，通過檢測這個標記物代替眾多細胞因子的檢測，顯示了iNOS作為這些疾病輔助診斷的價值。(三)其他疾病1.慢性神經(jīng)變性疾病 早老性癡呆和帕金森病人尸檢發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)iNOS的表達24。盡管神經(jīng)元對NO的細胞毒作用易感性最高，但iNOS表達是疾病晚期表現(xiàn)還是導致病情發(fā)展的原因尚未明。2.梗阻性病變 在兔心梗模型，給予特異的NOS抑制劑可明顯改善心室功能并增加存活心肌的血流量1。人心梗后心肌細胞及浸潤的巨噬細胞內(nèi)檢出iNOS酶蛋白，心臟移植后iNOS在心肌和血管平滑肌

18、細胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)中的表達似與收縮功能不全相關(guān)1。動物卒中模型顯示在梗塞區(qū)和腦損傷區(qū)有NOS表達?；蜃儺惖?nNOS和iNOS不全大鼠中，梗塞總量和神經(jīng)元損失明顯少于正常鼠；相反，eMOS不全的大鼠梗塞總量大于正常25。因此，低產(chǎn)量的 NO(由eNOS合成)似有利于增加梗塞中的腦血流量；而神經(jīng)元產(chǎn)生的 NO(由nNOS合成)和炎癥細胞iNOS合成的持續(xù)時間較長，產(chǎn)量高的NO可能有神經(jīng)元毒性作用1。以上資料表明，不同類型NOS所合成的NO在梗塞性病變的病理生理機制中起了不同的作用。3.腫瘤 在人的腦、肺、結(jié)腸1和前列腺26腫瘤的血管系統(tǒng)

19、，浸潤的巨噬細胞和腫瘤細胞均可能檢測到iNOS。NO在腫瘤發(fā)展中的作用也很復雜。實驗提示腫瘤中少量 NO的產(chǎn)生可增加腫瘤血流量并促進血管新生1；而腫瘤細胞自身產(chǎn)生的 NO可抑制細胞增殖(生長受阻)并/或誘導T淋巴細胞凋亡(細胞毒性)1。這可解釋經(jīng)常觀察到的現(xiàn)象：即伴隨腫瘤的生長，宿主免疫功能受到抑制。肝細胞可對幾種炎癥刺激作出應(yīng)答而產(chǎn)生NO，新近研究27表明慢性肝炎繼發(fā)肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)病人血清中NO產(chǎn)物水平明顯高于非HCC者，也明顯高于肝硬化(LC)并發(fā)HCC者。相關(guān)分析證實血清NO產(chǎn)物含量與HCC腫塊表面面積和腫塊體積呈正相關(guān)。認為NO在HC

20、C病人肝癌的巨噬細胞或枯否細胞誘導的腫瘤細胞毒性中起主要作用。iNOS的免疫組化染色顯示前列腺癌組織iNOS含量明顯上升，而良性的前列腺增生iNOS并不上升，提高前列腺上皮iNOS表達可作為前列腺癌特異性免疫組化標記，有助與增生的鑒別診斷。由iNOS產(chǎn)生的NO在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起了多方面的作用26。4.移植/植入 心臟同種移植的受體，iNOS的表達最多見于移植后第1個180天內(nèi)的心肌細胞和 VSMC，似乎和心臟收縮功能不全有因果關(guān)系1。在松馳了的關(guān)節(jié)假體周圍發(fā)現(xiàn)與排異炎癥反應(yīng)有關(guān)的各種細胞內(nèi)有iNOS表達28。被激活并吞噬有假體磨損碎片的巨噬細胞內(nèi)也有iNOS活動，這可能是造成早期假體

21、修復失敗的原因。5.損傷 用紫外線(ultraviolet,UV)-A或 UV-B照射后的正常人志愿者皮膚切片發(fā)現(xiàn)iNOS mRNA和iNOS酶蛋白分布于高度增殖的角化細胞的基層。iNOS表達高峰在照射后24h，而72h后未發(fā)現(xiàn)。這和日曬斑高峰于24h且持續(xù)2天的動力學特征相符。似乎表明了較長的日曬所引起的局部血流量增加和紅斑水腫形成是iNOS活動所致。不管是內(nèi)源性還是外源性的NO可保護人的皮膚內(nèi)皮細胞不被紫外光 UV-A誘導發(fā)生DNA斷裂和細胞凋亡29。動物實驗還證實 NO在損傷后愈合中起了積極的作用30。在創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)的動物模型發(fā)現(xiàn)

22、損傷后2448h于損傷周圍血管和浸潤的中性粒細胞內(nèi)有iNOS表達，人的TBI應(yīng)該也是相似的。三、小結(jié)在嚙齒動物的研究中，提示了 iNOS活動在實驗性自身免疫性或慢性炎癥過程及其他一些疾病中可能起了有害作用。然而，鑒于實驗性疾病病程短以及實驗動物種屬相對低等，其免疫反應(yīng)系統(tǒng)相對較簡單，調(diào)節(jié)也不像人類那樣復雜嚴密，為此，在人類疾病和iNOS表達的關(guān)系上，NO對這些疾病發(fā)生發(fā)展的意義尚須進一步深入研究。另外，iNOS表達最常見于上皮細胞，其因未明。在這方面，NO似作為一保護劑使細菌等侵入局限，并對炎癥反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用。還有，NO也影響基因調(diào)節(jié)，如通過抑制 NF-B活性或抑制 DNA與 NF-B、 AP

23、-l和鋅指(zine finger)轉(zhuǎn)錄因子 SPl來抑制 Thl類免疫反應(yīng)。在人類這種較高等動物中，iNOS的作用或許不是直接的細胞毒作用，而是基因調(diào)節(jié)作用(l)1。Fig 1 The same and the different action of iNOS in human and rodent1 人類和嚙齒動物iNOS作用的異同(引自Kroncke KD, Fehsel K & Bachofen VK: Inducible nitric oxide synthase in human disease, Clin Exp Immunol, 1998, 113:147)參 考 文 獻1 K

24、roncke KD， Fehsel K， Kold-Bachofen V. Inducible nitric oxide synthase in human diseasesJ.Clin Exp Immunol， 1998，l13:l47156.2 Hall AV, Antoniou H，Wang Y, et a1.Structural organization of the human neuranal nitric oxide synthase gene(NOSl)J.J Biol Chem，1994，269:3308233090.3 Nadaud S，Bonnardeaux A，Lath

25、rop M，et al，Gene structure polymorphism and mapping of the human endothelial nitric oxide synthase geneJ. Biochem Biophys Res Commun，1994,198:10271033.4 Marsden PA，Heng HHG，Duff CL，et a1.Localization of the human gene for inducible nitric oxide synthase(NOS2) to chromosome17q l1.2q12J. Genomics，1994

26、，19:l83185.5 Kroncke KD，F(xiàn)ehsel K，Kolb-Bachofen V. Nitric oxide：cytotoxicity versus cytoprotection， how， why， when， whereJ? NO Biol Chem，1997,l:l07120.6 Xu W， Charles IG，Liu L，et a1.Molecular cloning and structural organization of the inducible nitric oxide synthase gene (NOS2)J.Biochem Biophys Res C

27、ommun，1996,219:784788.7 Kun FJ，Mordmuller B，Lell B，et a1.Polymorphism in promoter region of inducible nitric oxide synthase gene and protection against malariaJ. Lancet，1998，351：265266.8 Spitsin SV， Farber JL，Bertovich M，et a1.Human- and mouse -inducible nitric oxide synthase promoters require activ

28、ation of phosphatidylcholine-specific phospholipase C and NF-kBJ. Mol Med，1997，3：315326.9 Kolyada AY, Savikovsky N，Madias NF. Transcriptional regulation of the human iNOS gene in vascular-muscle cells and macrophages：evidence for tissue-specificityJ.Biochem Biophys Res Commun，1996，220:600605.10 Linn

29、 SC， Morelli PJ，Edry I，et a1.Transcriptional regulation of human inducible nitric oxide synthase gene in an intestinal epithelial cell lineJ.Am J Physiol，1997,272:G1499508.11 Nunokawa Y ，Ishida N，Tanaka S.Promoter analysis of human inducible nutric oxide synthase gene associated with cardiovascular

30、homeostasisJ. Biochem Biophys Res Commun，1994,200:802807.12 Semenza GL, Wang GL. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthase binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activationJ.Mol Cell Biol，1994，12:54475454.13 Yoshioka K，Thompson J

31、， Miller MJS，et a1.Inducible nitric oxide synthase expression and erythropoietin production in human hepatocellular carcinoma cellsJ.Biochem Biophys Res Commun，1997,232:702706.14 Chu SC，Wu HP，Banks TC，et al. Structural diversity in the 5untranslated region of cytokine-stimulated human inducible nitr

32、ic oxide synthase mRNAJ. J Biol Chem，1995,270:1062510630.15 Zimmer A， Zimmer AM，Reynolds K.Tissue specific expression of the retinoic acid receptor- 2：regulation by short open reading frames in the 5-noncoding regionJ.J Cell Biol，1994,127:11111119.16 Nunkawa Y ,Oikawa S，Tanaka S.Expression of human

33、inducible nitric oxide synthase is regulated by both promoter and 3-regionsJ.Biochem Biophys Res Commun， 1997,233:523526.17 Lee SC，Dickson DW，Brosnan CF，et a1.Human astrocytes inhibit crytococcus neoformans growth by a nitric oxide- mediated machanismJ.J Exp Med，1994,180:365369.18 Evans TJ，Buttery L

34、DK，Carpenter A，et a1. Cytokine-treated human neutrophils contain inducible nitric oxide synthase that produces nitration of ingested bacteriaJ. Proc Natl Acad Sci USA，1996,93:95539558.19 Cobb JP,Danner RL.Nitric oxide and septic shockJ. JAMA, 1996,275:11921196.20 Thiemermann C.Nitric oxide and septi

35、c shockJ. Gen Pharmacol，1997,29:l59166.21 Steiner L，Kroncke KD， Fehsel K，et a1.Endothelial cells as cytotoxic effector cells；cytokine-activated islet endothelial cells lyse syngeneic islet cells via nitric oxideJ. Diabetologia，1997,40:l50155.22 Belmont HM ,Levartovsky D ,Goel A, et al.Increased nitric oxide production accompanied by the up-regulation of inducible nitric oxide synthase in vascular endothelium from patients with systemic lupus erythematosusJ. Arthritis Rheum ,1997,40(10):18101