快速老化小鼠的學(xué)習(xí)記憶缺陷及其生化機(jī)制

1、快速老化小鼠的學(xué)習(xí)記憶缺陷及其生化機(jī)制         11-01-10 11:09:00     作者：趙萬紅    編輯：studa20【摘要】  目的 用快速老化小鼠(SAMP8)模擬老年癡呆，觀察其學(xué)習(xí)記憶能力，并探討其學(xué)習(xí)記憶能力下降的可能機(jī)制。方法 采用10月齡SAMP8，并用同齡抗快速老化小鼠(SAMR1)作為正常對(duì)照。用水迷路檢測(cè)近記憶以及空間學(xué)習(xí)記憶能力。用生物化學(xué)方法檢測(cè)大腦皮層線粒體膜電位和ATP酶活力，

2、觀察線粒體功能；檢測(cè)皮層和海馬膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶(ChAT)和乙酰膽堿酯酶(AChE)的活力，觀察中樞膽堿能神經(jīng)功能；檢測(cè)血清超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛 (MDA)含量，觀察其全身性氧化應(yīng)激狀況。結(jié)果 與SAMR1相比，SAMP8出現(xiàn)明顯的衰老體征，其近記憶和空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯減弱，具有衰老和癡呆特征；皮層線粒體膜電位和ATP酶活力顯著降低，海馬ChAT活力顯著下降，AChE活力顯著升高，血清SOD活力稍有增高。結(jié)論 SAMP8可以很好地模擬老年癡呆，其機(jī)制包括大腦皮層線粒體功能降低、海馬膽堿能神經(jīng)功能下降以及氧化應(yīng)激等。 【關(guān)鍵詞】  快速老化小鼠 老年癡呆 線粒體 膽堿

3、能神經(jīng) 氧化應(yīng)激ABSTRACT: Objective  To simulate senile dementia with senescenceaccelerated mouse/prone 8 (SAMP8) and investigate its learning and memory deficits, and their biochemical mechanisms. Methods  The general status of SAMP8 was investigated compared with that of SAM/resistance 1 (SAMR1)

4、. Then their recent memory and spatial learning and memory abilities were detected with water maze. The mitochondrial membrane potential and adenosine triphosphatase (ATPase) of cortex were determined with biochemical method to investigate their mitochondrial function. The choline acetyltransferase

5、(ChAT) and acetylcholinesterase (AChE) activities of cortex and hippocampus were detected with the above method to observe their central cholinergic nerve function. The superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content in serum of mice were determined with biochemical method to o

6、bserve their general oxidative stress. Results  Compared with SAMR1, SAMP8 displayed significant senile physical signs, and weak recent memory and spatial learning and memory capabilities were similar to those characteristics of senescence and dementia. Meanwhile, the mitochondrial membrane pot

7、ential and ATPase activity of cortex, and the ChAT activity of hippocampus were lower than those of SAMR1, but the AChE activity of hippocampus was higher than that of SAMR1, and the serum SOD activity was slightly higher than that of SAMR1. Conclusion  SAMP8 may simulate senile dementia and it

8、s pathogenesis involves insufficient cortex mitochondrial function, decreased cholinergic nerve function, and oxidative stress.KEY WORDS: senescenceaccelerated mouse/prone 8(SAMP8); senile dementia; mitochondrion; cholinergic nerve function; oxidative stress快速老化小鼠(senescenceaccelerated mouse, SAM)是日

9、本京都大學(xué)Takeda等人通過對(duì)AKR/J系小鼠進(jìn)行篩選得到的品系，可分為兩個(gè)亞系，即P系和R系。前者稱為快速老化小鼠(SAM/prone, SAMP)，表現(xiàn)有脫毛、皮膚粗糙、行為障礙及生存期縮短等衰老現(xiàn)象，并有遺傳傾向；后者稱為抗快速老化小鼠(SAM/resistance, SAMR)，有正常的衰老過程1。SAM目前共有12個(gè)亞系，其中SAMP8主要以學(xué)習(xí)記憶功能呈增齡性衰退，中樞神經(jīng)系統(tǒng)如皮層、海馬等部位發(fā)生病理學(xué)改變?yōu)橹?3。文獻(xiàn)報(bào)道，SAMP8在增齡過程中腦內(nèi)有大量淀粉樣肽(A)沉積4，與學(xué)習(xí)記憶功能相關(guān)的腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)也發(fā)生相應(yīng)改變，如大腦皮層和海馬乙酰膽堿、去甲腎上腺素水平降低，阿片

10、肽、氨基丁酸水平升高，5羥色胺先升高后降低等56。SAMP8腦內(nèi)脂質(zhì)過氧化物含量與同齡SAMR1相比也升高，氧化抗氧化系統(tǒng)紊亂，出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷4,7，同時(shí)伴有明顯的線粒體功能紊亂8?？傊琒AMP8可以較好的模擬自然衰老過程中緩慢發(fā)生的老年癡呆，是研究衰老與學(xué)習(xí)記憶功能以及學(xué)習(xí)記憶功能障礙發(fā)生機(jī)制的良好動(dòng)物模型。    本研究用水迷路檢測(cè)SAMP8的近記憶和空間學(xué)習(xí)記憶能力，用生化方法測(cè)定其腦組織及血清與學(xué)習(xí)記憶和衰老相關(guān)的生化指標(biāo)，旨在明確衰老過程中，腦生化改變與智力衰退的相關(guān)性及可能機(jī)制。1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  S

11、AMP8和SAMR1各16只，10月齡，清潔級(jí)，購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，合格證：津?qū)崉?dòng)質(zhì)M準(zhǔn)字第006號(hào)。1.2  藥品和試劑  膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase, ChAT)試劑盒，批號(hào)20070228；乙酰膽堿酯酶 (acetylcholinesterase, AChE)試劑盒，批號(hào)20070226；三磷酸腺苷酶(adenosine triphosphatase, ATPase)試劑盒，批號(hào)20070228；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒，批號(hào)20070226；丙二醛 (malond

12、ialdehyde, MDA)試劑盒，批號(hào)20070226；考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒，批號(hào)20061211。以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。Rhodamine123為Sigma產(chǎn)品。1.3  儀器  水迷路由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制；MQX200型酶標(biāo)儀為美國Bio Tek Instruments產(chǎn)品。1.4  方法1.4.1  分組及設(shè)計(jì)  實(shí)驗(yàn)分兩組：SAMP8組和SAMR1組。首先進(jìn)行一般狀態(tài)的觀察，包括體征、體重，然后進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)及近記憶能力。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將動(dòng)物麻醉，頸動(dòng)脈取血制備血清，然后斷頭取

13、腦，分離皮層和海馬。將一側(cè)皮層及兩側(cè)海馬制備成100g/L的生理鹽水組織勻漿，另一側(cè)皮層用線粒體勻漿液制備成100g/L的勻漿，并提取線粒體。測(cè)定血清SOD活力和MDA含量，皮層和海馬ChAT、AChE活力以及皮層線粒體膜電位和ATP酶活力。1.4.2  水迷路實(shí)驗(yàn)  水迷路裝置是一個(gè)雙層不透明的方形塑料盒(80cm×50cm×20cm)，實(shí)驗(yàn)時(shí)盛水，其中有4個(gè)盲端和1個(gè)終點(diǎn)臺(tái)階，小鼠可沿此臺(tái)階爬出水面，起點(diǎn)則可以靈活設(shè)置。不同的起點(diǎn)含有的盲端數(shù)不同。通過測(cè)定小鼠在游泳過程中進(jìn)入盲端的錯(cuò)誤次數(shù)和到達(dá)終點(diǎn)所花費(fèi)的時(shí)間，判斷其近記憶和空間學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)時(shí)

14、，先將小鼠放在終點(diǎn)臺(tái)階上適應(yīng)5s，然后將其從起點(diǎn)放入水中，記錄進(jìn)入盲端的錯(cuò)誤次數(shù)和找到安全臺(tái)階花費(fèi)的時(shí)間，即逃避潛伏期，總時(shí)間限定3min，如在3min內(nèi)未找到臺(tái)階，則由實(shí)驗(yàn)人員將其引導(dǎo)至終點(diǎn)，潛伏期按3min計(jì)。訓(xùn)練及測(cè)試共5次，分別經(jīng)由含2、3、4、4、4個(gè)盲端的路線進(jìn)行。1.4.3  線粒體的提取及其膜電位的測(cè)定  將小鼠一側(cè)皮層按重量體積比19加入預(yù)冷的線粒體勻漿液，剪碎組織，轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器，手動(dòng)勻漿，4 2000g離心3min，取上清；上清于4 12500g離心8min，棄上清，取沉淀；沉淀用預(yù)冷的30g/L Ficoll液懸起，平鋪于預(yù)冷的60g/L Ficol

15、l液上，緩慢加速至11500g，離心30min，棄上清；以預(yù)冷的線粒體勻漿液洗沉淀后，再次懸于1mL預(yù)冷的勻漿液中，4 11500g離心10min，沉淀即為線粒體，重新懸于少量預(yù)冷的線粒體勻漿液中。用考馬斯亮蘭法標(biāo)定線粒體蛋白濃度，用勻漿液稀釋，使其蛋白質(zhì)量濃度在5mg/kg左右。    新鮮制備線粒體，96孔板每孔加入192L膜電位反應(yīng)緩沖液和4L Rhodamine123 (26mol/L)，酶標(biāo)儀上測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)503nm、發(fā)射波長(zhǎng)527nm條件下的基礎(chǔ)熒光值；然后加入不同實(shí)驗(yàn)組的線粒體蛋白溶液4L，混勻，立即開始計(jì)時(shí)，室溫放置30s后，連續(xù)測(cè)定4min內(nèi)熒光

16、值的變化。以每孔加入線粒體前的熒光值為基礎(chǔ)值，加入線粒體蛋白后的熒光強(qiáng)度以相應(yīng)熒光值相對(duì)于基礎(chǔ)值的變化量表示。1.4.4  生化檢測(cè)  從小鼠一側(cè)頸總動(dòng)脈取血，制備血清；然后將小鼠斷頭取腦，在冰浴上剝離出皮層和海馬組織，用濾紙吸干后稱重，按重量體積比19加入4預(yù)冷的生理鹽水，用內(nèi)切式勻漿機(jī)制備10%的組織勻漿；低溫低速離心10min，取上清棄沉淀，以備生化測(cè)定；用考馬斯亮蘭法標(biāo)定蛋白。皮層和海馬ChAT、AChE活力，皮層線粒體ATP酶活力以及血清SOD活力、MDA含量的測(cè)定均按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進(jìn)行。1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  數(shù)據(jù)以均

17、數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2  結(jié)果2.1  快速老化小鼠的一般狀態(tài)觀察  一般狀態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，與同齡SAMR1比較，多數(shù)10月齡SAMP8體型偏小，頭頸部、背部有毛發(fā)豎立、凌亂和脫落現(xiàn)象，有些背后部甚至出現(xiàn)光禿，行動(dòng)略顯遲緩，活躍程度降低；SAMR1則體格較大，毛發(fā)整齊、有光澤，活躍，行動(dòng)敏捷。SAMP8的平均體重(25.2±0.5)g，明顯低于SAMR1的平均體重(28.4±0.7)g(P<0.01)?？梢姡c同齡SAMR1比較，SAMP8出現(xiàn)了衰老體征。2.2

18、  快速老化小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力  水迷路實(shí)驗(yàn)常用于測(cè)試動(dòng)物的近記憶和空間學(xué)習(xí)記憶能力。通過測(cè)定動(dòng)物進(jìn)入盲端的錯(cuò)誤次數(shù)和找到臺(tái)階的潛伏期反映其學(xué)習(xí)記憶能力。本實(shí)驗(yàn)中，第一、二次采用的盲端總數(shù)分別為2和3個(gè)，第三到第五次則為4個(gè)。在前三次訓(xùn)練中，SAMP8和SAMR1進(jìn)入盲端的錯(cuò)誤次數(shù)沒有顯著差別；第三到五次測(cè)試中，兩組動(dòng)物進(jìn)入盲端的錯(cuò)誤次數(shù)均逐漸減少，表明動(dòng)物對(duì)臺(tái)階位置的記憶逐漸增強(qiáng)，但在第四、五次測(cè)試中，前者的錯(cuò)誤次數(shù)明顯多于后者，經(jīng)組間t檢驗(yàn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。第一、二次訓(xùn)練中，SAMP8找到臺(tái)階的潛伏期明顯長(zhǎng)于后者(P<0.05，P<0.001)，以后，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，二者找到臺(tái)階的潛伏期均逐漸縮短，但SAMP8的潛伏期非常明顯的長(zhǎng)于后者(P<0.001)。事實(shí)上，在