北京大學(xué)《藥物毒理學(xué)》4藥物毒理學(xué)-長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)

1、.長(zhǎng)期毒性長(zhǎng)期毒性(chronic toxicity )/重復(fù)給藥毒性重復(fù)給藥毒性(repeated dose toxicity) 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部 毒理學(xué)系毒理學(xué)系 姚碧云姚碧云 Tel：82801531.基本概念基本概念 長(zhǎng)期毒性長(zhǎng)期毒性/ /重復(fù)給藥毒性重復(fù)給藥毒性(repeated dose toxicity )： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反復(fù)多次接觸反復(fù)多次接觸藥物所引起的毒性反應(yīng)藥物所引起的毒性反應(yīng) 長(zhǎng)期的期限主要取長(zhǎng)期的期限主要取決于藥物臨床擬用的期限決于藥物臨床擬用的期限，一般為臨，一般為臨床擬用期限的床擬用期限的23倍。倍。 還應(yīng)有適當(dāng)?shù)幕謴?fù)期還應(yīng)有適當(dāng)?shù)幕謴?fù)期。 包含了

2、不同給藥周期的毒性，即包含了不同給藥周期的毒性，即2828天天毒性、毒性、1-31-3個(gè)月毒個(gè)月毒性、性、6-126-12個(gè)月個(gè)月毒性。毒性。.物質(zhì)蓄積（物質(zhì)蓄積（material accumulation）：）： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反復(fù)多次接觸化學(xué)物后，用化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)動(dòng)物反復(fù)多次接觸化學(xué)物后，用化學(xué)分析方法能夠測(cè)得機(jī)體內(nèi)存在該化學(xué)物或其代謝產(chǎn)物方法能夠測(cè)得機(jī)體內(nèi)存在該化學(xué)物或其代謝產(chǎn)物 效應(yīng)效應(yīng)/損傷蓄積損傷蓄積(damage/effect accumulation) ： 有的化學(xué)物在長(zhǎng)期接觸后，機(jī)體內(nèi)雖不能測(cè)出有的化學(xué)物在長(zhǎng)期接觸后，機(jī)體內(nèi)雖不能測(cè)出其原型或代謝產(chǎn)物，卻出現(xiàn)了慢性毒性作用。其原型或代

3、謝產(chǎn)物，卻出現(xiàn)了慢性毒性作用。.n蓄積作用（蓄積作用（accumulation)：外源化學(xué)物進(jìn)入機(jī)：外源化學(xué)物進(jìn)入機(jī)體后經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化排出體外。當(dāng)其連續(xù)地、反復(fù)體后經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化排出體外。當(dāng)其連續(xù)地、反復(fù)地進(jìn)入機(jī)體，而且吸收速度超過代謝轉(zhuǎn)化與排泄地進(jìn)入機(jī)體，而且吸收速度超過代謝轉(zhuǎn)化與排泄速度時(shí)化學(xué)物在體內(nèi)的量逐漸增加，稱為化學(xué)物速度時(shí)化學(xué)物在體內(nèi)的量逐漸增加，稱為化學(xué)物的蓄積作用。的蓄積作用。如洋地黃、依米丁、溴化物或含汞、砷、鉛中藥等代謝緩如洋地黃、依米丁、溴化物或含汞、砷、鉛中藥等代謝緩慢而毒性較高慢而毒性較高、.二、亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)的目的二、亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)的目的 確定受試藥物確定受

4、試藥物長(zhǎng)期毒性的效應(yīng)譜、毒性特點(diǎn)及靶器官長(zhǎng)期毒性的效應(yīng)譜、毒性特點(diǎn)及靶器官。 研究藥物長(zhǎng)期毒性的劑量研究藥物長(zhǎng)期毒性的劑量-反應(yīng)反應(yīng)(效應(yīng)效應(yīng))關(guān)系，確定其關(guān)系，確定其 LOAEL和和NOAEL，提出受試藥物的安全限量參考值提出受試藥物的安全限量參考值 研究受試藥物研究受試藥物長(zhǎng)期損害的可逆性長(zhǎng)期損害的可逆性 確定確定物種間的毒效應(yīng)的差異物種間的毒效應(yīng)的差異，為將毒性研究結(jié)果外推到，為將毒性研究結(jié)果外推到人提供依據(jù)。人提供依據(jù)。.長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)方法長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)方法The Methods of Chronic Toxicity Study v 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和染毒期限實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和染毒期限v 染

5、毒途徑染毒途徑v 試驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)試驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)v 觀察指標(biāo)觀察指標(biāo).l一般選擇兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，一種為一般選擇兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，一種為嚙齒類動(dòng)物嚙齒類動(dòng)物，另一種為另一種為非嚙齒類動(dòng)物非嚙齒類動(dòng)物。l常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：大鼠、狗大鼠、狗、猴、猴一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇和染毒期限一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇和染毒期限實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇. 1-3個(gè)月毒性試驗(yàn)個(gè)月毒性試驗(yàn) 年齡：大鼠年齡：大鼠80100g（6-8 周齡）周齡） 狗狗 812月月 小鼠小鼠1015g數(shù)量：嚙齒類數(shù)量：嚙齒類20 犬犬68性別：雌雄各半性別：雌雄各半 612個(gè)月毒性試驗(yàn)個(gè)月毒性試驗(yàn)?zāi)挲g：大鼠年齡：大鼠: 初斷乳初斷乳

6、5070g 狗狗 6個(gè)月6個(gè)月（嚙齒類）9個(gè)月（非嚙齒類）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒期限實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒期限v 中國SFDA v ICH.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒期限實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒期限.原則：盡量模擬人類接觸受試物的方式原則：盡量模擬人類接觸受試物的方式( (途徑途徑) )；并且亞慢；并且亞慢 性與慢性毒性試驗(yàn)的染毒途徑應(yīng)當(dāng)一致。常用性與慢性毒性試驗(yàn)的染毒途徑應(yīng)當(dāng)一致。常用二、染毒途徑二、染毒途徑 經(jīng)胃腸道經(jīng)胃腸道： 經(jīng)皮膚染毒：經(jīng)皮膚染毒： 經(jīng)呼吸道：經(jīng)呼吸道：. 高劑量組：高劑量組： 能引起較為明顯的毒性作用能引起較為明顯的毒性作用 3 3個(gè)劑量組個(gè)劑量組 中劑量組：中劑量組： 應(yīng)為應(yīng)為L(zhǎng)OAEL 低劑量組：低劑量組：應(yīng)

7、相當(dāng)于應(yīng)相當(dāng)于NOAEL 陰性陰性( (溶劑溶劑) )對(duì)照組對(duì)照組。為了要得出明確的劑量為了要得出明確的劑量- -反應(yīng)關(guān)系，和確定未觀察到有害作用反應(yīng)關(guān)系，和確定未觀察到有害作用劑量劑量(NOAEL)，因此至少應(yīng)設(shè)：，因此至少應(yīng)設(shè)：三、試驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)三、試驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì).1-3個(gè)月毒性試驗(yàn)的劑個(gè)月毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)量設(shè)計(jì)n 高劑量組高劑量組 急性毒性的閾劑量急性毒性的閾劑量 1/201/5 LD50n 中劑量組中劑量組n 低劑量組低劑量組n 陰性對(duì)照組陰性對(duì)照組n 組距：組距：3-10倍，最低倍，最低 不小于不小于2倍倍 6個(gè)月毒性試驗(yàn)的劑量個(gè)月毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)設(shè)計(jì) 高劑量組高劑量組

8、亞慢性毒性的亞慢性毒性的MTD或其或其1/51/2 中劑量組中劑量組 低劑量組低劑量組 陰性對(duì)照組陰性對(duì)照組 組距：組距：25倍，最低不倍，最低不小小于于2倍倍1 1以相同物種的毒性資料作基礎(chǔ)以相同物種的毒性資料作基礎(chǔ) 試驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)試驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì).劑量范圍研究劑量范圍研究（Range-finding study劑量范圍研究設(shè)計(jì)劑量范圍研究設(shè)計(jì)嚙齒類嚙齒類 組別劑量(mg/kg/天，或ppm)動(dòng)物數(shù)實(shí)驗(yàn)開始結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)室檢查大體尸解組織病理學(xué)檢查I*最高劑量雌5/雄5雌5/雄5全部存活動(dòng)物雌5/雄5II*高劑量雌5/雄5雌5/雄5全部存活動(dòng)物必要時(shí)III*中劑量雌5/雄5雌5/雄5全部存

9、活動(dòng)物必要時(shí)IV*低劑量雌5/雄5雌5/雄5全部存活動(dòng)物必要時(shí)V0溶劑對(duì)照雌5/雄5雌5/雄5全部存活動(dòng)物雌5/雄5 實(shí)驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì).劑量范圍研究設(shè)計(jì)劑量范圍研究設(shè)計(jì)非嚙齒類非嚙齒類 組別劑量(mg/kg/天，或ppm)動(dòng)物數(shù)實(shí)驗(yàn)開始試驗(yàn)前和結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)室檢查大體尸解組織病理學(xué)檢查I*最高劑量雌1/雄1雌1/雄1全部存活動(dòng)物雌1/雄1II*高劑量雌1/雄1雌1/雄1全部存活動(dòng)物雌1/雄1III*中劑量雌1/雄1雌1/雄1全部存活動(dòng)物雌1/雄1IV*低劑量雌1/雄1雌1/雄1全部存活動(dòng)物雌1/雄1V0 溶 劑 對(duì)照雌1/雄1雌1/雄1全 部 存 活 動(dòng)物雌1/雄1給以受試物給

10、以受試物2周，此為常見的和推薦最低的實(shí)驗(yàn)周期。如要得到更多的信息，實(shí)驗(yàn)周期周，此為常見的和推薦最低的實(shí)驗(yàn)周期。如要得到更多的信息，實(shí)驗(yàn)周期可為可為4周。周。 實(shí)驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì). 如對(duì)劑量選擇沒有把握，則可在該次實(shí)驗(yàn)中多設(shè)幾個(gè)劑量組，如對(duì)劑量選擇沒有把握，則可在該次實(shí)驗(yàn)中多設(shè)幾個(gè)劑量組， 這比重復(fù)整個(gè)試驗(yàn)費(fèi)用低得多。這比重復(fù)整個(gè)試驗(yàn)費(fèi)用低得多。 急性急性/單劑量毒性試驗(yàn)單劑量毒性試驗(yàn)劑量范圍發(fā)現(xiàn)研究劑量范圍發(fā)現(xiàn)研究90天毒性試驗(yàn)。天毒性試驗(yàn)。 急性急性/單劑量毒性試驗(yàn)單劑量毒性試驗(yàn)14/28天毒性試驗(yàn)天毒性試驗(yàn)90天毒性試驗(yàn)天毒性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì) 直

11、接從急性毒性資料來確定慢性毒性試驗(yàn)的劑量經(jīng)常有困難，直接從急性毒性資料來確定慢性毒性試驗(yàn)的劑量經(jīng)常有困難， 可能高估或低估受試物的長(zhǎng)期毒性?？赡芨吖阑虻凸朗茉囄锏拈L(zhǎng)期毒性。.l 如資料來自如資料來自相同物種相同物種，低劑量原則上應(yīng)，低劑量原則上應(yīng)高于高于同種動(dòng)物藥效學(xué)試驗(yàn)同種動(dòng)物藥效學(xué)試驗(yàn) 或功能學(xué)試驗(yàn)的或功能學(xué)試驗(yàn)的有效劑量有效劑量， 并不使動(dòng)物出現(xiàn)毒性反應(yīng)。并不使動(dòng)物出現(xiàn)毒性反應(yīng)。l 如資料來自如資料來自另一物種另一物種, ,應(yīng)根據(jù)體表面積換算應(yīng)根據(jù)體表面積換算受試物種的藥效學(xué)或受試物種的藥效學(xué)或 功能學(xué)等效劑量，并據(jù)此設(shè)計(jì)低劑量組的劑量水平。功能學(xué)等效劑量，并據(jù)此設(shè)計(jì)低劑量組的劑量水平。

12、2、藥物或保健食品：、藥物或保健食品： 以動(dòng)物試驗(yàn)藥效學(xué)或功能學(xué)資以動(dòng)物試驗(yàn)藥效學(xué)或功能學(xué)資 料作基礎(chǔ)確定低劑量組水平開始設(shè)計(jì)。料作基礎(chǔ)確定低劑量組水平開始設(shè)計(jì)。 實(shí)驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì). 實(shí)驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組和劑量設(shè)計(jì)3、對(duì)于藥物或保健食品，、對(duì)于藥物或保健食品，低劑量組低劑量組應(yīng)適當(dāng)應(yīng)適當(dāng)高于高于預(yù)期臨預(yù)期臨床治療或人擬用最大劑量的等效劑量。床治療或人擬用最大劑量的等效劑量。 保健食品保健食品: : 100倍，倍， 化學(xué)藥品化學(xué)藥品: : 30倍，倍， 中藥中藥: : 50倍。倍。4 4、當(dāng)預(yù)期受試物、當(dāng)預(yù)期受試物無明顯毒性無明顯毒性時(shí)，長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的時(shí)，長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的

13、最高最高劑量至少等于人擬用最大劑量的倍數(shù)劑量至少等于人擬用最大劑量的倍數(shù). .5、用以上幾種方法進(jìn)行亞慢性和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的劑、用以上幾種方法進(jìn)行亞慢性和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)，結(jié)果也許會(huì)不一致，甚至?xí)嗖钜粋€(gè)數(shù)量設(shè)計(jì)，結(jié)果也許會(huì)不一致，甚至?xí)嗖钜粋€(gè)數(shù)量級(jí)，這時(shí)就需要量級(jí)，這時(shí)就需要根據(jù)以往試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)判斷，或根據(jù)以往試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)判斷，或增加劑量組以保證得到良好的劑量反應(yīng)關(guān)系增加劑量組以保證得到良好的劑量反應(yīng)關(guān)系。.四、觀察指標(biāo)四、觀察指標(biāo). 1、一般性指標(biāo)一般性指標(biāo) 動(dòng)物的外觀動(dòng)物的外觀(體表通道和毛色等體表通道和毛色等)、社會(huì)行為、社會(huì)行為(躁動(dòng)、冷漠、探究躁動(dòng)、冷漠、探究 活動(dòng)；刺激性活動(dòng)；

14、刺激性(好斗好斗)等等 體重、飼料消耗及食物利用率體重、飼料消耗及食物利用率. 2、實(shí)驗(yàn)室檢查：、實(shí)驗(yàn)室檢查： 血液學(xué)血液學(xué) 尿液尿液 臨床生化臨床生化 3、眼科學(xué)檢查眼科學(xué)檢查 4、血壓和心電圖的測(cè)量：通常限于非嚙齒類。、血壓和心電圖的測(cè)量：通常限于非嚙齒類。 觀察指標(biāo)觀察指標(biāo)活體評(píng)價(jià)（活體評(píng)價(jià)（In-life evaluation）.2處死后評(píng)價(jià)（處死后評(píng)價(jià)（Post-Mortem evaluation） 1 1、尸體解剖尸體解剖 vv 試驗(yàn)結(jié)束，活殺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。采血進(jìn)行上述實(shí)試驗(yàn)結(jié)束，活殺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。采血進(jìn)行上述實(shí) 驗(yàn)室檢查，并系統(tǒng)解剖，測(cè)定臟器重量。驗(yàn)室檢查，并系統(tǒng)解剖，測(cè)定臟器重量。 v

15、v 臟器系數(shù)臟器系數(shù)(relative organ weight): 某個(gè)臟器濕某個(gè)臟器濕 重重/體重體重 的比值的比值, *100% 觀察指標(biāo)觀察指標(biāo).vv 肉眼可見的損傷或可疑損傷部位都應(yīng)作進(jìn)一步組織學(xué)檢查。肉眼可見的損傷或可疑損傷部位都應(yīng)作進(jìn)一步組織學(xué)檢查。vv 對(duì)照組和高劑量組動(dòng)物以及系統(tǒng)解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)的異常組織均需對(duì)照組和高劑量組動(dòng)物以及系統(tǒng)解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)的異常組織均需 作詳細(xì)的組織學(xué)檢查，作詳細(xì)的組織學(xué)檢查，嚙齒類動(dòng)物嚙齒類動(dòng)物3636種，非嚙齒類動(dòng)物種，非嚙齒類動(dòng)物3939種。種。vv 在吸入毒性研究中，需檢查整個(gè)呼吸道。經(jīng)皮毒性試驗(yàn)應(yīng)選在吸入毒性研究中，需檢查整個(gè)呼吸道。經(jīng)皮毒性試驗(yàn)應(yīng)

16、選取涂敷受試物部位的皮膚和相鄰部位的皮膚。取涂敷受試物部位的皮膚和相鄰部位的皮膚。 vv 應(yīng)評(píng)價(jià)器官組織病理改變的性質(zhì)和發(fā)生率。如果病理組織學(xué)應(yīng)評(píng)價(jià)器官組織病理改變的性質(zhì)和發(fā)生率。如果病理組織學(xué) 損害程度進(jìn)行半定量評(píng)價(jià)，將易于判斷損害是否由于受試物損害程度進(jìn)行半定量評(píng)價(jià)，將易于判斷損害是否由于受試物 誘發(fā)的損害是否隨染毒劑量和時(shí)間增加而嚴(yán)重。誘發(fā)的損害是否隨染毒劑量和時(shí)間增加而嚴(yán)重。2、病理學(xué)檢查、病理學(xué)檢查.3. 特異性指標(biāo)特異性指標(biāo) 觀察指標(biāo)觀察指標(biāo)效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志效應(yīng)生物學(xué)標(biāo)志是反映受試物對(duì)機(jī)體毒作用本質(zhì)的是反映受試物對(duì)機(jī)體毒作用本質(zhì)的特征性指標(biāo)，并常與其毒作用機(jī)制特征性指標(biāo)，并常與其毒作

17、用機(jī)制有關(guān)。有關(guān)。.4. 指標(biāo)觀察時(shí)間指標(biāo)觀察時(shí)間 一般指標(biāo)：每天觀察一次一般指標(biāo)：每天觀察一次 體重、飼料消耗量：每周一次體重、飼料消耗量：每周一次 試驗(yàn)室檢查：試驗(yàn)室檢查： 亞慢性毒性試驗(yàn)：試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，必要時(shí)可在亞慢性毒性試驗(yàn)：試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，必要時(shí)可在 試驗(yàn)中間進(jìn)行一次試驗(yàn)中間進(jìn)行一次 慢性毒性試驗(yàn)：試驗(yàn)中期活殺少量動(dòng)物及試慢性毒性試驗(yàn)：試驗(yàn)中期活殺少量動(dòng)物及試 驗(yàn)結(jié)束時(shí)，全面檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，全面檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo). 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析：數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析： Data Processing and Results Assessment .研究資料的匯總研究資料的匯總計(jì)量資料：按組別（必要時(shí)按

18、性別）進(jìn)行匯總并求出每組計(jì)量資料：按組別（必要時(shí)按性別）進(jìn)行匯總并求出每組 的均數(shù)的均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)差 計(jì)數(shù)資料：用相對(duì)數(shù)（率、比）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，求出每組計(jì)數(shù)資料：用相對(duì)數(shù)（率、比）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，求出每組 的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差.統(tǒng)計(jì)學(xué)比較統(tǒng)計(jì)學(xué)比較 根據(jù)數(shù)據(jù)類型選用合適的統(tǒng)計(jì)方法，進(jìn)行各劑根據(jù)數(shù)據(jù)類型選用合適的統(tǒng)計(jì)方法，進(jìn)行各劑量組與陰性對(duì)照組的比較。量組與陰性對(duì)照組的比較。.與對(duì)照組比較差別在統(tǒng)與對(duì)照組比較差別在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是否的顯著性計(jì)學(xué)上是否的顯著性。該差別是否與受試物相關(guān)，是該差別是否與受試物相關(guān)，是否是受試物引起的生物學(xué)效應(yīng)否是受試物引起的生物學(xué)效應(yīng)該效應(yīng)是否是有害效應(yīng)該效應(yīng)是否是

19、有害效應(yīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義統(tǒng)計(jì)學(xué)意義生物學(xué)意義生物學(xué)意義毒理學(xué)意義毒理學(xué)意義. 判別處理組與對(duì)照組間差別有生物學(xué)意義應(yīng)考慮的因素判別處理組與對(duì)照組間差別有生物學(xué)意義應(yīng)考慮的因素 劑量依賴性趨勢(shì)劑量依賴性趨勢(shì) 劑量劑量- -反應(yīng)關(guān)系是反映效應(yīng)與處理因素相關(guān)最重要反應(yīng)關(guān)系是反映效應(yīng)與處理因素相關(guān)最重要 的指標(biāo)之一，如果劑量組與對(duì)照組結(jié)果之間存在差的指標(biāo)之一，如果劑量組與對(duì)照組結(jié)果之間存在差 異，并且效應(yīng)的大小隨劑量水平的增加而改變，可異，并且效應(yīng)的大小隨劑量水平的增加而改變，可 判定效應(yīng)與受試物有關(guān)。判定效應(yīng)與受試物有關(guān)。 結(jié)果的重現(xiàn)性結(jié)果的重現(xiàn)性 試驗(yàn)結(jié)果可以重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果可以重復(fù)，基本可以確定與受試物有關(guān)。基本可以