關(guān)于組蛋白高乙?；閷?dǎo)的Egr

1、關(guān)于組蛋白高乙?；閷?dǎo)的Egr-1結(jié)合促進(jìn)gdnf基因高轉(zhuǎn)錄膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GNDF)是一種新型的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-(TGF-)超家族成員，在胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)量迅速上調(diào)，至成年期維持在較低程度。由于GDNF對(duì)多巴胺能神經(jīng)元特異的營(yíng)養(yǎng)作用，一直作為治療帕金森病的潛在藥物而備受關(guān)注。最近的研究說(shuō)明，GDNF還是膠質(zhì)瘤細(xì)胞強(qiáng)有力的促增殖因子，它在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于正常膠質(zhì)細(xì)胞，并且可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。目前，有關(guān)GDNF對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞促增殖和遷移機(jī)制的研究很多，但是對(duì)于gdnf基因高轉(zhuǎn)錄的發(fā)活力制卻知之甚少?；虻漠惓８咿D(zhuǎn)錄通常與基因突變以及表觀遺傳學(xué)改變有

2、關(guān)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中g(shù)dnf基因的異常高轉(zhuǎn)錄與基因突變無(wú)關(guān)，而與該基因啟動(dòng)子II區(qū)組蛋白H3K9的高乙?；揎椨嘘P(guān)。諸多的研究已說(shuō)明，啟動(dòng)子區(qū)組蛋白的高乙酰化修飾可以使該區(qū)域染色質(zhì)中的核小體呈排列松散的開(kāi)放狀態(tài)，從而利于轉(zhuǎn)錄因子與之的結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游(-186 bp)存在3個(gè)連續(xù)且高度保守的轉(zhuǎn)錄因子Egr-1的結(jié)合序列，且Egr-1參與了膠質(zhì)細(xì)胞中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和丙咪嗪誘導(dǎo)的gdnf轉(zhuǎn)錄激活。由此我們推測(cè)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中g(shù)dnf基因啟動(dòng)子II區(qū)組蛋白高乙?；赡芤陨咿D(zhuǎn)錄因子Egr-1與之結(jié)合才能的方式引發(fā)該基

3、因的異常高轉(zhuǎn)錄。為了驗(yàn)證以上假說(shuō)，我們以大鼠C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，利用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)的方法檢測(cè)了以上兩種細(xì)胞中g(shù)dnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域H3K9的乙?；潭纫约癊gr-1與之的結(jié)合才能;通過(guò)組蛋白乙?；?HAT)抑制劑Curcumin和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制劑TSA16建立的gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)乙?；淖兊腃6膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型，檢驗(yàn)了gdnf基因啟動(dòng)子區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域組蛋白乙?；揎棾潭?、Egr-1與之的結(jié)合才能以及該基因轉(zhuǎn)錄程度之間是否存在必然的聯(lián)絡(luò)。1 材料和方法1.1 主要試劑大鼠C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和正常

4、星形膠質(zhì)細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室凍存。 DMEM/F12培養(yǎng)基胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco，ChIP級(jí)兔源抗乙酰化組蛋白H3(Lys9)多克隆抗體(貨號(hào)07-352)、EZ-ChIP試劑盒購(gòu)自Millipore，兔源抗Egr-1多克隆抗體(貨號(hào)sc-110X)購(gòu)自Santa Cruz，Curcumin、TSA 和二甲基亞砜(DMSO)均購(gòu)自 Sigma-Aldrich，TRIzol 購(gòu)自 Invitrogen，Prime ScriptTMII 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMII 試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa。1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理將實(shí)驗(yàn)室凍存的大鼠正常星形膠質(zhì)細(xì)胞和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞

5、復(fù)蘇于含有10%胎牛血清(美國(guó)Gibco)的DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)的培養(yǎng)液中，置于37 ，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q1次液。取23代生長(zhǎng)良好的大鼠C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，以1105/ml細(xì)胞濃度接種于六孔板，每孔2 ml。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%集合度時(shí)，將培養(yǎng)液更改為含有0.5%牛血清白蛋白(美國(guó)Sigma-Aldrich)的無(wú)血清Opti-MEM(美國(guó)Invitrogen)，在一樣條件下培養(yǎng)24 h。然后再更換為含有TrichostatinA(終濃度為200 nmol/ L)或Curcumin(終濃

6、度為50 mol/L)(均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich)的新穎無(wú)血清 Opti-MEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 24h，其中對(duì)照組添加等體積的溶劑DMSO。1.3 ChIP-PCR染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)使用兔抗乙?；疕3K9抗體、兔抗Egr-1多克隆抗體和正常兔源 IgG，按EZ-ChIP chromatin immunoprecipitation kit 說(shuō)明書(shū)的步驟操作。ChIP實(shí)驗(yàn)后，采用real-time PCR的方法檢測(cè)目的抗體免疫沉淀下來(lái)的DNA。PCR反響體系為：12.5 l SYBR Premix Ex TaqTMII;上下游引物(F：5CGAGGAGGTGCAGAGT

7、GAGG3， R： 5GGGAG-CAAGAGCACGCAA 310 mol/L)各 1 l 以及 DNA模板3 加滅菌消毒的雙蒸水補(bǔ)充至總體積25 l。用三步法PCR反響程序(預(yù)變性：95 2 min;PCR反響：95 15 s，60 30 s，72 20 s，共40個(gè)循環(huán))進(jìn)展擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物大小為283 bp。Real-time PCR后采用2-Ct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)展相對(duì)定量，以%Input的形式計(jì)算結(jié)果：%Input =2(CtInput-CtChIP)Input dilution factor100。Real-time PCR引物由康成生物(上海)公司合成。1.4 Real-time PC

8、R采用TRIzol(Invitrogen)一步法從細(xì)胞中提取總RNA，以1 g 總RNA為模板按Prime ScriptTMII逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明行逆轉(zhuǎn)錄反響合成cDNA第一鏈。利用SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒在反響體系(20 l)下進(jìn)展實(shí)時(shí)定量PCR：SYBR Premix ExTaqTMII 10 l、上下游引物(10 mol/L)各0.5 l、cDNA模板1 l和無(wú)核酶水8 l。通過(guò)LightCycler480 熒光定量 PCR 系統(tǒng)(Roche)進(jìn)展實(shí)時(shí)熒光定量分析。反響條件設(shè)置如下：95 預(yù)變性30 s;95 變性20 s，60 退火15 s;72 延伸15 s，

9、擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。通過(guò)溶解曲線分析PCR產(chǎn)物特異性。每個(gè)樣品以gapdh基因的mRNA表達(dá)作為內(nèi)參照，通過(guò)相對(duì)定量(2-CT)法計(jì)算目的基因在各樣品中相對(duì)mRNA的表達(dá)程度。靶基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增的上下游引物序列見(jiàn)表1。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS16.0進(jìn)展處理，計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示。其中，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析。取P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 超聲斷裂染色質(zhì)后DNA的電泳結(jié)果大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)超聲破碎染色質(zhì)后各取20 l直接進(jìn)展解交聯(lián)和純化 2%瓊脂2.2 大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形

10、膠質(zhì)細(xì)胞中g(shù)dnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)處H3K9的乙?；潭菴hIP-PCR結(jié)果顯示：大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中g(shù)dnf基因啟動(dòng)子II區(qū)的組蛋白H3K9均發(fā)生了不同程度的乙?；揎棥Ｅc正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中g(shù)dnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域組蛋白H3K9的乙?；潭葮O顯著升高(P0.01，圖2)。2.3 大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中Egr-1與gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)的結(jié)合情況ChIP-PCR結(jié)果顯示：C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子Egr-1都可以不同程度地與gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)潛在的Egr-1結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域結(jié)合。與

11、正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Egr-1與gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)的結(jié)合量極顯著升高(P0.01，圖3)。2.4 大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中g(shù)dnf基因啟動(dòng)子II區(qū)H3K9乙?；揎椊閷?dǎo)的Egr-1與之的結(jié)合才能調(diào)節(jié)該基因的轉(zhuǎn)錄我們采用Curcumin和TSA的藥物處理建立了gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)處乙酰化程度改變的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型，即50 mol/L Curcumin處理24 h后，顯著降低了gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)處H3K9的乙?；潭?相反的，200 nmol/LTSA處理24 h后，顯著進(jìn)步gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)處H3K9的乙

12、?；潭?圖4A)。在此根底上，采用ChIP-PCR和real-time PCR技術(shù)檢測(cè)了gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)H3K9乙?；揎椄淖儗?duì)Egr-1與之的結(jié)合才能及該基因轉(zhuǎn)錄程度的影響。結(jié)果顯示，gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)處H3K9低乙?；揎?，減少Egr-1與之的結(jié)合的同時(shí)，降低了gdnf mRNA的表達(dá)(P而且，gdnf 基因啟動(dòng)子 II 區(qū) Egr-1 結(jié)合位點(diǎn)處H3K9高乙酰化修飾，在促進(jìn)Egr-1與之結(jié)合的同時(shí)，進(jìn)步了gdnf mRNA的表達(dá)(P0.05，圖4B，C)。3 討論Egr-1是gdnf基因活化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。為了探明gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)組蛋白H3K9高

13、乙?；揎棿龠M(jìn)該基因高轉(zhuǎn)錄的作用機(jī)制，我們利用ChIP-PCR的方法檢測(cè)了大鼠C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中該啟動(dòng)子區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域組蛋白H3K9的乙?；癄顟B(tài)。K9是組蛋白H3調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄激活最為活潑的乙?；稽c(diǎn)。結(jié)果顯示，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中g(shù)dnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1靶向區(qū)域發(fā)生了組蛋白H3K9的高乙酰化修飾(圖2)，與我們之前的研究結(jié)果相似，說(shuō)明組蛋白H3K9高乙酰化修飾可能影響到Egr-1與gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)的結(jié)合。為了驗(yàn)證以上推測(cè)，我們利用ChIP-PCR的方法檢測(cè)了大鼠C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中Egr-1與gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)潛在的結(jié)合位點(diǎn)的

14、結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Egr-1可以與gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)潛在的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，并且較之正常膠質(zhì)細(xì)胞Egr-1的結(jié)合量顯著升高(圖3)，與我們的推測(cè)相一致。此外，Shin 等人發(fā)現(xiàn)缺失Egr-1結(jié)合位點(diǎn)顯著下調(diào)了gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)的啟動(dòng)活性，說(shuō)明Egr-1的結(jié)合可以促進(jìn)gdnf基因的轉(zhuǎn)錄活性。由此，我們提出本文的假說(shuō)，gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)組蛋白高乙?；閷?dǎo)的Egr-1與之結(jié)合量的升高促進(jìn)了C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中該基因的高轉(zhuǎn)錄。為了進(jìn)一步證實(shí)以上假說(shuō)，我們利用以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果挑選了Curcumin和TSA處理C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的最正確作用時(shí)間及作用濃度，并在此根底上建立了gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)乙?；淖兊腃6膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型。發(fā)現(xiàn)，Egr-1呈組蛋白H3K9乙?；蕾嚨姆绞浇Y(jié)合到gdnf啟動(dòng)子II區(qū)，并且促進(jìn)了gdnf基因的轉(zhuǎn)錄，與我們的預(yù)期相符(圖4)。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了大鼠C6星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，gdnf基因啟動(dòng)子II區(qū)Egr-1結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域組蛋白H3K9發(fā)生了高乙?；揎?，并且Egr-1與之的結(jié)合才能也顯著升高(Pgdnf基因的轉(zhuǎn)錄程度以及Egr-1與該基因啟動(dòng)子的結(jié)合才能，都隨著Egr-1