MHC分子在誘導(dǎo)口腔鱗癌CTL中的作用

1、    MHC分子在誘導(dǎo)口腔鱗癌CTL中的作用        【摘要】目的探討腫瘤細(xì)胞上的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)分子在誘導(dǎo)自體口腔鱗癌細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）中的作用。方法對(duì)9例口腔鱗癌中的腫瘤細(xì)胞表面人類(lèi)白細(xì)胞抗原 (human leukocyte antigen，HLA)-ABC和HLA-DR抗原進(jìn)行檢測(cè)，將其中5例HLA-ABC抗原表達(dá)>50

2、%和HLA-DR抗原表達(dá)>35%的病例作為研究對(duì)象：自體腫瘤細(xì)胞經(jīng)處理后作刺激細(xì)胞，并用MHC單抗阻斷刺激細(xì)胞上的HLA-ABC和（或）HLA-DR抗原，檢測(cè)自體腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的CTL的特異性殺傷活性及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-的分泌水平。阻斷靶細(xì)胞上HLA-ABC和（或）HLA-DR抗原，觀察MHC單抗對(duì)自體刺激細(xì)胞（未加單抗處理）誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞毒的抑制作用。結(jié)果各病例的各實(shí)驗(yàn)組刺激細(xì)胞誘導(dǎo)的CTL殺傷活性均顯著低于對(duì)照組，依次為：DR抗原陽(yáng)性刺激細(xì)胞組ABC抗原陽(yáng)性刺激細(xì)胞組ABC和DR抗原均陰性刺激細(xì)胞組，抗ABC 單抗可完全阻斷CTL特異

3、性分泌TNF-；各實(shí)驗(yàn)組單抗對(duì)CTL的殺傷活性的平均抑制率分別為：抗ABC單抗為52%；抗DR 單抗為27%；抗ABC 單抗+抗DR 單抗為72%。結(jié)論口腔鱗癌細(xì)胞上的MHC-I、II類(lèi)抗原在誘導(dǎo)自體CTL中起重要作用?！娟P(guān)鍵詞】癌，鱗狀細(xì)胞；口腔腫瘤；T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞毒性 The role of MHC molecules on OSCC cells in the induction of autologous cytotoxic T lymphocytesYANG Hongyu，LI Jinrong，ZHAO Yifang（Department of Stomatology，The Thi

4、rd Affiliated Hospital ，Sun Yet-Sen University of Medical Sciences， Guangzhou 510630，China）【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of major histocompatibility complex（MHC） molecules in the induction of cytotoxic T lymphocyte（CTL） from oral squamous cell carcinoma. MethodsThe treated autologous tu

5、mor cells served as stimulating cells，on which the MHC mAb was used to block the HLA-ABC and/or HLA-DR antigens.The specific cytotoxicity of CTL induced by stimulating cells and the level of released TNF- were then detected. By blocking the HLA-ABC and/or HLA-DR antigens on target cells , the inhibi

6、tion effect of MHC mAb on CTL cytotoxicity induced by autologous stimulating cells (not treated with mAb) was measured. Results The cytotoxicity induced by stimulating cells in experimental groups was significantly lower than that of the control group. The successive order was: the DR antigen positi

7、ve stimulating cell group > ABC antigen positive stimulating cell gooup > both ABC and DR antigen negative stimulating cell group . The specific TNF- released by CTL was completely blocked by anti-ABC mAb.The average inhibition rate by mAb on cytotoxicity of CTL was: 52%,27% and 72% by anti-AB

8、C mAb, anti-DR mAb, and anti-ABC mAb plus anti-DR mAb respectively. Conclusion Both MHC-class I and class antigens on OSCC cells play an important role in inducing CTL.【Key words】Carcinoma，squamous cell； Mouth neoplasms； T-lymphocytes，cytotoxic多數(shù)腫瘤的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex, MHC）-I

9、類(lèi)抗原均有丟失或不同程度的降低，這種降低或丟失可能會(huì)影響MHC-I類(lèi)抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）或CTL細(xì)胞毒作用。關(guān)于人黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌中MHC-I類(lèi)分子限制性腫瘤特異的CTL的研究已有較多報(bào)道。人頭頸鱗癌中MHC-I類(lèi)抗原表達(dá)較高，而MHC-類(lèi)抗原相對(duì)較低1-3。那么表達(dá)MHC-I類(lèi)抗原的口腔鱗狀細(xì)胞癌的CTL及CTL細(xì)胞毒活性是否也存在MHC的限制性呢？我們對(duì)此進(jìn)行初步探討 。材料及方法1病例選擇： 經(jīng)病理證實(shí)的口腔鱗癌患者9例，術(shù)前均未經(jīng)放療及化療。男7例，女2例，年齡4167歲。其中頰癌3例，舌癌5例, 口底癌1例。為探討

10、口腔鱗癌細(xì)胞MHC抗原在誘導(dǎo)CTL或CTL細(xì)胞毒中的作用，對(duì)9例口腔鱗癌新鮮分離的腫瘤細(xì)胞表面HLA-ABC和HLA- DR抗原進(jìn)行檢測(cè)，選其中5例HLA-ABC抗原表達(dá)>50%和HLA- DR抗原表達(dá)均>35%的病例作為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。2方法：（1） 腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的分離： 用酶消化和不連續(xù)梯度密度的淋巴細(xì)胞分離液將腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞分離 。然后將分離的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)或凍存，作為細(xì)胞毒測(cè)定中的靶細(xì)胞或自體腫瘤刺激細(xì)胞。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor-infiltration lymphocyte，TIL）以2.5×108 個(gè)細(xì)胞/ L的濃度置于含10%胎

11、牛血清、PG 5×104IU/ L、鏈霉素50 mg/ L、慶大霉素50 mg/ L、rIL-2 1 ×106 U/ L的完全培養(yǎng)液中在37，5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（2）刺激細(xì)胞的制備：復(fù)蘇的自體腫瘤細(xì)胞中加絲裂霉素C，50 mg/L,37 ，30 min；用培養(yǎng)液洗4次；腫瘤細(xì)胞再懸于完全培養(yǎng)基中，每個(gè)病例分4組；分別加入鼠抗人HLA-ABC 單抗（monoclonal antibody, mAb）, HLA- DR mAb, HLA-ABC mAb + HLA- DR mAb，20 mg/L, 4, 1 h后作為刺激細(xì)胞，對(duì)照組不加單抗（單抗購(gòu)于解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）

12、。 （3）腫瘤細(xì)胞表面HLA-ABC和HLA-DR抗原的檢測(cè)： 取5×108/L的被測(cè)瘤細(xì)胞，按適當(dāng)比例加入人抗鼠HLA-ABC mAb 和HLA- DR mAb，1組不加單抗，4孵育30 min，洗滌3次；再加入適當(dāng)比例異硫氰酸熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG，4孵育30 min，洗滌3次，F(xiàn)ACS檢測(cè)。（4）CTL的誘導(dǎo)：采用淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞混合培養(yǎng)法誘生CTL 。 5×109 個(gè)細(xì)胞/L TIL和5×108 U/ L絲裂霉素C處理的自體腫瘤細(xì)胞5%CO2 ，37條件下共培養(yǎng)。5 d后，再加入rIL-2 1×106 U/ L，培養(yǎng)2周，每23 d換液1次，

13、并補(bǔ)充rIL-2。（5）細(xì)胞毒活性的測(cè)定：采用3H-TdR（購(gòu)于中國(guó)原子能研究院，比活度為3.7×104 MBq/L 4 h釋放法4檢測(cè)MHC誘導(dǎo)的CTL的細(xì)胞毒活性，效靶比為501。（6）抗HLA-ABC和HLA-DR單抗對(duì)CTL細(xì)胞毒活性的抑制作用：靶細(xì)胞的制備： 每孔加入50 l自體腫瘤細(xì)胞，每孔加入1.85 ×104 Bq 3 H-TdR, 37、5%CO2 12 h ，充分清洗后，加入50 l anti-HLA-ABC mAb或（和）anti-HLA-DR mAb, 4 下1 h， 每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)3組復(fù)孔。效應(yīng)細(xì)胞的制備：自體腫瘤細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素C處理后，洗滌4次，

14、 然后按刺激細(xì)胞：TIL110加入自體TIL，37 、5% CO2 培養(yǎng)5 d 后，加入rIL-2 1 ×106 U/ L, 再培養(yǎng)2周。以效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞501，測(cè)殺傷活性。（7）特異性TNF-的分泌：將抗體阻斷和未阻斷的刺激細(xì)胞與自體TIL（501）共同培養(yǎng)2472 h后收集上清液，用ELISA法檢測(cè)TNF- （解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）。 結(jié)果1. HLA-ABC和DR抗原在口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)： 5例口腔鱗癌細(xì)胞HLA-ABC抗原的表達(dá)為57.98%83.24%, HLA-DR抗原表達(dá)為35.87%41.89%。2. HLA-ABC和DR在誘導(dǎo)CTL中的作用：對(duì)照組（HLA-ABC

15、和DR雙陽(yáng)性的刺激細(xì)胞）誘導(dǎo)的CTL殺傷活性最強(qiáng)。與各自的對(duì)照組相比，各個(gè)病例的各實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)的CTL殺傷活性均顯著降低。5例統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，各實(shí)驗(yàn)組均小于對(duì)照組，依次為：DR抗原陽(yáng)性刺激細(xì)胞組（P0.005) ABC抗原陽(yáng)性刺激細(xì)胞組（P0.002 5）ABC和DR抗原均陰性刺激細(xì)胞組（P0.001)。3. MHC抗原在誘導(dǎo)CTL細(xì)胞毒中的抑制作用：為了證實(shí)MHC抗原在誘導(dǎo)CTL細(xì)胞毒中的抑制作用，將經(jīng)絲裂霉素C處理的自體腫瘤細(xì)胞作刺激細(xì)胞（HLA-ABC和DR抗原均陽(yáng)性細(xì)胞），誘導(dǎo)CTL。然后將靶細(xì)胞上MHC抗原用HLA-ABC和DR單抗阻斷，結(jié)果顯示：抗HLA-ABC單抗阻斷組，抑制率

16、可達(dá)45%59%，平均為52%；抗HLA-DR單抗阻斷組，抑制率為21%38%，平均為27%；抗HLA-ABC單抗DR單抗阻斷后，抑制率為64%77%，平均72%。4. TNF-的特異性釋放：抗HLA-ABC單抗能完全阻斷CTL特異性釋放TNF- ，抗HLA-DR單抗能部分阻斷CTL釋放TNF-。討論TIL的抗瘤作用主要依賴(lài)于其中的CTL直接殺傷腫瘤細(xì)胞。但CTL抗原對(duì)癌細(xì)胞的識(shí)別及CTL對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)具有高度特異性，它只殺傷表面帶有特異性腫瘤抗原和MHC-I類(lèi)分子的靶細(xì)胞?？鼓[瘤T細(xì)胞的免疫效應(yīng)包括兩種T細(xì)胞亞群的功能, 即MHC-I類(lèi)抗原限制的CD8+T細(xì)胞和MHC-類(lèi)抗原限制的CD4

17、+T細(xì)胞。T細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別必須同時(shí)識(shí)別靶細(xì)胞上的特異抗原和MHC分子， 形成T細(xì)胞受體（TCR）- 多肽 - MHC分子復(fù)合體， 向CTL傳遞識(shí)別信號(hào)。因此弄清CTL抗腫瘤作用與MHC分子的關(guān)系對(duì)提高腫瘤的免疫治療效果具有重要意義。MHC-I類(lèi)抗原編碼的基因位點(diǎn)和抗原系列包括HLA-A、-B、-C， MHC-類(lèi)抗原包括HLA-D、-DR、-DQ、-DP。本研究結(jié)果表明：HLA-ABC和HLA-DR抗原均陽(yáng)性的刺激細(xì)胞（未加單抗）誘導(dǎo)的CTL對(duì)自體腫瘤細(xì)胞的殺傷活性最強(qiáng)，其余依次為HLA-ABC陽(yáng)性刺激細(xì)胞（DR阻斷）> HLA-DR陽(yáng)性刺激細(xì)胞（ABC阻斷）> HLA-ABC和

18、DR均陰性刺激細(xì)胞（ABC和DR均阻斷）。而將靶細(xì)胞上HLA-ABC和DR抗原阻斷后，對(duì)自體刺激細(xì)胞（HLA-ABC和DR抗原均陽(yáng)性）誘導(dǎo)的CTL的殺傷活性的抑制率分別為：HLA-ABC 和DR 抗原均阻斷組為72%， ABC抗原 阻斷組為52%，DR阻斷組平均為27%。刺激細(xì)胞中ABC抗原阻斷后， 誘導(dǎo)的CTL仍有殺傷活性及靶細(xì)胞上ABC抗原阻斷后仍不能完全阻斷CTL的殺傷活性，說(shuō)明了CTL的異質(zhì)性。我們過(guò)去的研究表明， TIL中主要為CD4+和CD8+T細(xì)胞及少量NK細(xì)胞。因此，我們認(rèn)為，本實(shí)驗(yàn)中5例口腔鱗癌誘導(dǎo)的CTL中存在MHC-I類(lèi)抗原限制的CD8+T 細(xì)胞和MHC-類(lèi)抗原限制的CD

19、4+T細(xì)胞。有研究表明，在黑色素瘤中，只有DR陽(yáng)性的黑色素瘤細(xì)胞才能誘導(dǎo)TIL的增殖，DR在自體TIL中有重要作用5。在自體腫瘤刺激下，CD4+ T細(xì)胞 可產(chǎn)生IL-2、GM-CSF，從而誘導(dǎo)和維持CD8+T細(xì)胞的增殖6，7。本研究也證實(shí)了DR抗原在誘導(dǎo)CTL中的作用。因?yàn)閷R抗原阻斷后，可抑制CTL 21%38%的殺傷活性，也說(shuō)明與DR抗原結(jié)合的CD4+T細(xì)胞在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起重要作用。本研究中， 阻斷靶細(xì)胞上HLA-ABC和DR抗原后， 仍然不能完全阻斷 CTL 的殺傷活 性，表明CTL中存在不受MHC抗原限制的殺傷細(xì)胞，如NK細(xì)胞。由于TNF-的抗腫瘤及對(duì)CTL的正向調(diào)節(jié)作用而備受重視

20、，但CTL在未活化前自分泌細(xì)胞因子能力很差。本研究表明，抗HLA-ABC單抗雖不能完全阻斷CTL的殺傷活性，卻可以完全阻斷CTL分泌TNF-。用HLA-DR抗原不能刺激CTL釋放TNF-，說(shuō)明本研究中CTL釋放的TNF-主要為CD8+T細(xì)胞分泌。以上說(shuō)明，表達(dá)HLA-ABC和DR抗原的口腔鱗癌細(xì)胞誘導(dǎo)的CTL中存在MHC-I類(lèi)抗原限制的TC細(xì)胞、MHC-類(lèi)抗原限制性的TH細(xì)胞及非MHC限制性的NK細(xì)胞，它們共同完成對(duì)自體腫瘤的殺傷功能。(本文編輯：孔繁軍）基金項(xiàng)目：湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（95129）作者單位：楊宏宇（430079 武漢，湖北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科；現(xiàn)在中山醫(yī)科大學(xué)

21、第三附屬醫(yī)院口腔科，510630）李金榮（430079 武漢，湖北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科）趙怡芳（430079 武漢，湖北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科）王秀麗（430079 武漢，湖北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科）盧海蓉（武漢生物制品研究所腫瘤研究室）參考文獻(xiàn)1，Vora AR, Rodgers S, Parker AJ, et al. An immunohistochemical study of altered immunomodulatory molecule expression in head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer, 1997,76: 836-844.2，Mattijsen V, De Mulder PHM,Schalkwijk L,et al. HLA antigen expression routinely processed head and neck squamous cell carcinoma primary lesions of different sites. Int J Cancer, 1991 Suppl 6:95-100.3，Houck JR, Sexton FM, Zajdel G . HLA class I and class antig