可誘導(dǎo)表達(dá)腦啡肽的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞株的構(gòu)建

1、    作者：徐穎,田玉科,田學(xué)愎,梅偉,安珂,楊輝【關(guān)鍵詞】  可誘    comConstruction of an immortalized rat astrocyte strain with inducible enkephalin expression    【Abstract】 AIM: To construct an immortalized rat astrocyte strain (IAST) expressing enkephalin regulated by Doxycyc

2、line. METHODS:  Human preproenkephalin gene (hPPE) was inserted into the plasmid pRevTRE to construct recombinant retroviral vector pRevTRE/hPPE. pRevTetOn and pRevTRE/hPPE were separately transfected into packaging cell PT67. The RevTetOn virus supernatants were used to infect IAST and po

3、sitive colonies were transiently transfected with pRevTRELuc plasmid. One IAST/TetOn clone with high inducibility and low background was selected by detecting luciferase activity. RevTRE/hPPE virus was used to infect the IAST/TetOn strain. IAST that stably expressed Tetregulated enkephalin was estab

4、lished. hPPE gene expression levels of IAST/TetOn/hPPE cell strains were detected by RTPCR, immunocytochemistry and indirect immunofluorescence staining. RESULTS:  A recombinant retroviral vector pRevTRE/hPPE was constructed successfully. The inducibility multiple of the IAST/TetOn cell st

5、rain was 20.6. RTPCR and immunocytochemistry confirmed that enkephalin expression level was regulated by Doxycycline in a dosedependent manner. CONCLUSION:  An IAST which secretes enkephalin under the control of Doxycycline has been established successfully, which provides a good basis for

6、 further research on regulated gene therapy for chronic pain.    【Keywords】 human preproenkephalin; gene expression regulation; polyomavirus transforming; astrocyte    【摘要】 目的：構(gòu)建受強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)表達(dá)腦啡肽的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞株（IAST）. 方法：應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建含人前腦啡肽原基因（hPPE)的逆轉(zhuǎn)錄病毒四環(huán)素反應(yīng)質(zhì)粒（pRevTRE/hPPE）；以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pRev

7、TRE/hPPE和調(diào)節(jié)質(zhì)粒pRevTetOn分別轉(zhuǎn)染入包裝細(xì)胞PT67,分別收集病毒上清；將含有RevTetOn病毒上清感染IAST,挑選單克隆并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染報(bào)告質(zhì)粒pRevTRELuc,通過檢測螢光素酶活性,挑選出強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)表達(dá)高、背景表達(dá)低IAST/TetOn細(xì)胞株；再將RevTRE/hPPE病毒上清感染IAST/TetOn細(xì)胞株,得到穩(wěn)定表達(dá)腦啡肽的IAST/TetOn/hPPE細(xì)胞株,通過RTPCR、免疫細(xì)胞化學(xué)及間接免疫熒光染色檢測該細(xì)胞株中強(qiáng)力霉素定量調(diào)控腦啡肽的表達(dá). 結(jié)果：重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRevTRE/hPPE構(gòu)建成功；經(jīng)挑選得到了高表達(dá)、低背景IAST/TetOn細(xì)胞株,其

8、誘導(dǎo)倍數(shù)為20.6；在IAST/TetOn/hPPE細(xì)胞株中,hPPE基因表達(dá)受強(qiáng)力霉素調(diào)控,呈劑量依賴關(guān)系. 結(jié)論：成功構(gòu)建了受四環(huán)素及其衍生物強(qiáng)力霉素定量調(diào)控表達(dá)腦啡肽的永生化IAST,為可調(diào)控基因治療慢性疼痛的研究奠定了基礎(chǔ).    【關(guān)鍵詞】 人前腦啡肽；基因表達(dá)調(diào)控；多瘤病毒轉(zhuǎn)化；星形膠質(zhì)細(xì)胞    0引言    轉(zhuǎn)基因細(xì)胞移植鎮(zhèn)痛為慢性疼痛的治療開辟了新領(lǐng)域1,但傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因鎮(zhèn)痛模式不能調(diào)控鎮(zhèn)痛物質(zhì)的分泌,外源鎮(zhèn)痛基因在宿主體內(nèi)持續(xù)表達(dá)可帶來諸多不良后果. TetOn基因調(diào)控系統(tǒng)通過四環(huán)素及其衍生物強(qiáng)力霉素來調(diào)節(jié)目的基因的

9、定量表達(dá),是在分子水平精確調(diào)控外源基因表達(dá)的較好工具2-3. 為安全有效實(shí)施轉(zhuǎn)基因鎮(zhèn)痛,我們擬運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄病毒四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng),建立可誘導(dǎo)表達(dá)腦啡肽的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞株（immortalized rat astrocyte strain, IAST）,并在體外觀察強(qiáng)力霉素對(duì)腦啡肽表達(dá)的定量調(diào)節(jié).    1材料和方法    1.1材料原代培養(yǎng)的永生化IAST系本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建4. 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體RevTetOn系統(tǒng)（包括調(diào)節(jié)質(zhì)粒pRevTeton、反應(yīng)質(zhì)粒pRevTRE、報(bào)告基因pRevTRELuc、包裝細(xì)胞PT67，Tet系統(tǒng)專用血清）購自Clontech公司；

10、表達(dá)載體pCMVhPPE(含目的基因hPPE )由美國學(xué)者Wilson博士惠贈(zèng)；DH5感受態(tài)細(xì)菌由本室制備. Polybrene，G418，強(qiáng)力霉素購自美國Sigma公司. 各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶為日本TaKaRa公司產(chǎn)品. Lipofectamin2000TM為Invitrogen公司產(chǎn)品. MMLV Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄酶及螢光素酶分析試劑盒購自Promega公司. 亮氨酸腦啡肽多克隆抗體購自美國Chemicon公司. 螢光發(fā)光計(jì)TD20/20為Turner Biosystem公司產(chǎn)品.    1.2方法   

11、 1.2.1可調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)GenBank中hPPE基因序列(No：AH005276)及pRevTRE多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)引物,引物兩端分別帶有BamH,Hind酶切位點(diǎn). 上游引物：5CGGATCCTCCTCAGTGGACGTT3（含有BamH酶切位點(diǎn)）；下游引物CCAAGCTTAACACCATCAACAGTT3（含有Hind酶切位點(diǎn)）. 以表達(dá)載體pCMV/hPPE為模板PCR擴(kuò)增hPPE基因片段. 瓊脂糖電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,凝膠回收950 bp的hPPE基因片段, 用BamH，Hind雙酶切后,與BamH，Hind線性化的載體pRevTRE連接,獲得重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pR

12、evTRE/hPPE,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5,挑選陽性菌落,提取質(zhì)粒DNA, 經(jīng)PCR、酶切分析及DNA序列測定鑒定.    1.2.2逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包裝脂質(zhì)體（lipofectamine）介導(dǎo)分別將質(zhì)粒pRevTRE/hPPE，pRevTetOn轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PT67. 質(zhì)粒pRevTeton含有新霉素抗性基因（Neo）,經(jīng)G418（500 mg/L）篩選后,獲得穩(wěn)定產(chǎn)生RevTeton病毒的包裝細(xì)胞系PT67RevTeton；質(zhì)粒pRevTRE/hPPE含有潮霉素抗性基因（Hyg）,經(jīng)潮霉素(500 mg/L)篩選后,獲得穩(wěn)定產(chǎn)生RevTRE/hPPE病毒的

13、包裝細(xì)胞系PT67RevTRE/hPPE.    1.2.3螢光素酶活性檢測將含有RevTeton病毒上清感染IAST細(xì)胞株,經(jīng)G418 (500 mg/L)篩選后得到抗性克隆,采用有限稀釋法挑選單克隆,共形成48個(gè)單細(xì)胞克隆,命名為IAST/TetOn,分別編號(hào)為No.1No.48. 報(bào)告質(zhì)粒pRevTRELuc和pCMVgal共轉(zhuǎn)染到48個(gè)IAST/TetOn細(xì)胞克隆,加入強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)螢光素酶表達(dá). 檢測螢光素酶的活性（按螢光素酶分析試劑盒說明書進(jìn)行）,半乳糖苷酶作為轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)標(biāo). 具體操作見文獻(xiàn)5. 標(biāo)準(zhǔn)螢光素酶活性值螢光素酶活性值（RLU，relative luc

14、iferase unit）/半乳糖苷酶活性值（A420 nm）. 根據(jù)測得的標(biāo)準(zhǔn)螢光素酶活性值計(jì)算強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)倍數(shù)：誘導(dǎo)倍數(shù)=（強(qiáng)力霉素孔標(biāo)準(zhǔn)螢光素酶活性值）/（強(qiáng)力霉素孔標(biāo)準(zhǔn)螢光素酶活性值）. 挑選誘導(dǎo)表達(dá)高、背景表達(dá)低的細(xì)胞克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行下一步試驗(yàn).    1.2.4強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)hPPE表達(dá)的檢測將含有RevTRE/hPPE病毒上清感染IAST/TetOn細(xì)胞克隆,經(jīng)潮霉素400 mg/L，G418 400 mg/L共同篩選后獲得穩(wěn)定表達(dá)hPPE基因IAST/TetOn細(xì)胞株,命名為IAST/TetOn/hPPE. 在六孔板中加入含IAST/TetOn/hPPE細(xì)

15、胞數(shù)1×108/L的細(xì)胞懸液1 mL, 培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入不同濃度的強(qiáng)力霉素（0, 0.1, 1, 10 mg/L）誘導(dǎo)培養(yǎng),并以未轉(zhuǎn)染基因hPPE的IAST細(xì)胞作為陰性對(duì)照細(xì)胞. 72 h后,用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA,采用半定量RTPCR分析強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)hPPE表達(dá)水平. 按照RTPCR試劑盒說明書,逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈,取等量的cDNA為模板加入目的基因hPPE或內(nèi)參照肌動(dòng)蛋白上、下游引物進(jìn)行30輪PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,采用凝膠圖像分析儀測定目的基因hPPE和肌動(dòng)蛋白的積分光密度值（integrated opt

16、ical density, IOD）, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次. hPPE基因表達(dá)強(qiáng)度以hPPE基因和肌動(dòng)蛋白IOD比值的均數(shù)表示.    1.2.5間接免疫熒光染色檢測強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)hPPE表達(dá)水平將細(xì)胞IASTTetOn/hPPE制成細(xì)胞爬片,一組培養(yǎng)液中加入強(qiáng)力霉素1 mg/L,另一組培養(yǎng)液不加強(qiáng)力霉素做為陰性對(duì)照. 培養(yǎng)72 h后甲醇固定,加入亮氨酸腦啡肽多克隆抗體（11000）,4過夜；再加FITC標(biāo)記熒光二抗（1100）室溫孵育1 h；PBS漂洗3次,PI復(fù)染細(xì)胞核1 min,加甘油緩沖液封片,尼康TE2000S熒光顯微鏡下觀察. 免疫熒光強(qiáng)度的判定方法如下：熒光閃亮,呈明

17、顯的亮綠色；：熒光明亮,呈黃綠色, ：熒光較弱,但清楚可見；±：極弱的可疑熒光；：無熒光.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 采用SPSS 10.0軟件對(duì)RTPCR半定量結(jié)果進(jìn)行Spearman相關(guān)分析,P0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.    2結(jié)果    2.1重組質(zhì)粒的酶切鑒定及DNA序列測定用BamH，Hind雙酶切pRevTRE/hPPE,出現(xiàn)兩條特異性條帶,大片段與空載體pRevTRE相同（約6400 bp）,小片段與hPPE PCR產(chǎn)物相同,約950 bp,與酶切圖譜相符,證實(shí)重組質(zhì)粒中含有hPPE基因（圖1）.M: marker; 1:PCR鑒定重組體pR

18、evTRE/hPPE; 2:BamH和Hind雙酶切重組體 pRevTRE/hPPE; 3:BamH單酶切重組體p RevTRE/hPPE; 4: BamH單酶切pRevTRE.圖1重組質(zhì)粒pRevTRE/hPPE的酶切鑒定及PCR鑒定    2.2高誘導(dǎo)表達(dá)低背景表達(dá)螢光素酶IAST/TetOn細(xì)胞株的挑選經(jīng)過有限稀釋法挑選,共形成48個(gè)陽性克隆細(xì)胞. 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pRevTREluc,強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)前后螢光素酶活性見圖2. 挑選6號(hào)克隆的細(xì)胞作為高誘導(dǎo)低背景表達(dá)細(xì)胞株. 從圖2看出其誘導(dǎo)表達(dá)值為876.1 RLU/A420 nm, 背景表達(dá)值為42.5 RLU/A420 nm,